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ちょっと趣旨から離れますが、、、 削除/引用 No.2659-12 - 2010/06/04 (金) 23:58:38 - Boston 私は U937 をモデル細胞として、学位を取得しました。審査の際、幹細胞研究で著明な先生より、「細胞株を使った実験が、どれほど生体内に存在する細胞の機能を理解するのに役立つのか？」とコメントを頂きました。末梢血単核細胞は、サイトカイン処理することにより、マクロファージにも、樹状細胞へも分化します。サイトカインを購入する金銭的な問題もあるかと思いますが、あえて U937 にこだわる理由はないかと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.2659-11 - 2010/06/04 (金) 16:53:50 - この4月から研究デビュー kanata様、何度もお付き合いいただきありがとうございます。 今はPMAの濃度や処理時間、培地交換のタイミングなどを比較検討しています。 次は、FBSあり/なしも比較してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2659-10 - 2010/06/04 (金) 08:19:49 - Kanata 私は参考にした文献がFBS抜きの培地で一晩置いてから刺激、という内容に なっていたので、それにあわせました。 お話を伺った方の中には、FBS枯渇させたほうが刺激の効果があがるとおっしゃっていた方もいらっしゃいましたが・・・ う937さんの書き込みを参考に、今度はFBS入れたまま試してみようと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.2659-9 - 2010/06/03 (木) 15:50:22 - この4月から研究デビュー kanata様、う937様、ありがとうございます。 FBSはずっと入ったままでやっていました。 PMA刺激の際は、FBSを抜いたほうがよいのでしょうか？ また、刺激の前に細胞周期を合わせたりしたほうがよいのでしょうか？ 何度も質問して申し訳ありませんが、アドバイスをいただけると助かります。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2659-8 - 2010/06/03 (木) 13:47:56 - う937 うちの系では96時間TPA入れっぱなしでもかなりの割合でくっついています。FBSは入れています。

(無題) 削除/引用 No.2659-7 - 2010/06/03 (木) 02:17:12 - Kanata 私の実験では、細胞は若干大きいもの（刺激前より）が張り付いてました。 PMAの刺激の際に、FBSを抜いた培地を使いませんか？Co-factorなどが枯渇するわけで、その状態で長く細胞をかっていると剥がれやすくなる印象があります。そのため刺激の後半からFBSをいれた培地に切り替えていたのですが・・・他の皆さんの経験談を伺えるといいですね。 PBMCからだと細胞は足を伸ばしてくるのでわかりやすいです。 THP−１の場合も足を伸ばした形態で接着しますよ。

ありがとうございます 削除/引用 No.2659-6 - 2010/06/02 (水) 14:43:22 - この4月から研究デビュー 皆様、ご返信ありがとうございます。 参考にさせていただきます。 もうひとつお伺いしたいのですが、 分化した（接着した）細胞はどのような様子でしょうか？ 私どもの場合、PMA添加の24時間後の細胞はぷりっと丸っこいまま、ディッシュにくっついています。 いわゆる接着細胞のように、ディッシュにビタッとがっつりと張り付いている感じではありません。 （言葉だけで説明するのは難しいですね…） そのため、24時間では分化が不十分なのかと思い、もう一日培養を続けてみました。 すると、8-9割の細胞が剥がれて浮いてしまっていました。 PMAを添加したままでも、24時間後に培地交換してPMAを除去しても、同じ結果です。 私の調べた限りでは多くのプロトコルでは、PMAを添加してから実験に使用するまで48-72hくらい培養しているようでした。 しかし私どもの場合、48時間以上経過すると剥がれてしまいます。 24時間で十分に分化しているとみなしてよいものか心配です。 それに48時間で剥がれてしまうと、この先実験に使うにも微妙です。

(無題) 削除/引用 No.2659-5 - 2010/06/02 (水) 05:18:11 - Kanata つい最近、U937を使ってマクロファージへの分化を試みていました。 1）分化の確認 　一般的には細胞が付着したことで「分化」とする論文が多いようですが、 中にはphagocytosis能を検討した上で分化を判定している論文もありました。実験の目的によりけりです。私は細胞の付着に加え、FACSで確認を試みましたが、よいマーカーが見つからなかったこともあって曖昧な結果でした。THP-1だったら、分化後の写真の載った論文を知ってます。 2）条件 安定した結果を得ていないのでご参考にはならないかもしれませんが、 私は10ng/mlで48−72h刺激しています。その後培地を半分だけ通常のものに交換し、2日ほどたってから完全にPMAフリーの培地にするなど、検討していますが、細胞によりけりといった状況です。 十分な情報ではないと思いますが、ご参考までに。

PMA濃度及び培養時間 削除/引用 No.2659-4 - 2010/06/02 (水) 03:41:28 - ダメな大学生 さしでがましいかもしれませんが、私が行っている条件でよければ。 PMAは20 nMから100 nMで行っています。培養時間は24~48時間後。 とりあえず、20nM、24時間培養から行ってみて下さい。 分化が悪かったり、貪食率が低ければ培養時間を増やせば多少改善されるかと思います。 ちなみに私が行っている条件は100 nMで48時間培養です。 ただ、U937細胞の状態にかなり左右されるのでその点には注意して下さい。

説明不足ですみません 削除/引用 No.2659-3 - 2010/06/01 (火) 11:05:33 - この4月から研究デビュー >[Re:2] 初めてのさんは書きました : > >とりあえず、10nM-PMAで24時間刺激後、通常の培地に交換して48h程度インキュベーションしてみましたが、とても分化しているように見えません。 > > とあるのに > > >また、分化の確認はどのように行ったらよいでしょうか？ > > と質問されているのは？？？ 色々調べると、U937をPMAで刺激するとマクロファージに分化し、同時に活性化されてディッシュに接着するようになると書いてあります。 分化しているように見えないと書いたのは、細胞が浮遊したままで接着していなかったからです。 ちなみに、ディッシュは細胞培養用にコーティングをしたものを使用しており、ディッシュの材質のせいで接着しないというわけではないと考えています。 条件検討の結果、細胞がディッシュに接着するようにはなってきましたが、きちんと分化しているのかわかりません。 確認方法が知りたいです。 論文など探していますが、分化前後の細胞の画像や、分化の確認などの記述が見当たりません。

(無題) 削除/引用 No.2659-2 - 2010/05/31 (月) 18:17:56 - 初めての >とりあえず、10nM-PMAで24時間刺激後、通常の培地に交換して48h程度インキュベーションしてみましたが、とても分化しているように見えません。 とあるのに >また、分化の確認はどのように行ったらよいでしょうか？ と質問されているのは？？？ 実験始めたばかりなのなら、まずは実験の正攻法を学ぶべきです。 上司とよく相談をし、論文を読むなどして進めましょう。

U937をマクロファージに分化させたい 削除/引用 No.2659-1 - 2010/05/31 (月) 15:37:03 - この4月から研究デビュー お世話になります。 U937細胞をPMAで刺激し、マクロファージに分化させて実験に使用したいと考えております。 プロトコールを調べてみると、PMAの濃度やインキュベーション時間がいろいろでした。 とりあえず、10nM-PMAで24時間刺激後、通常の培地に交換して48h程度インキュベーションしてみましたが、とても分化しているように見えません。 成功したプロトコールをお持ちの方がおりましたら、教えていただけませんでしょうか？ また、分化の確認はどのように行ったらよいでしょうか？ 分化マーカーのようなものがあれば、教えていただけると助かります。

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