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BiFC法を用いた局在解析 トピック削除
No.2658-TOPIC - 2010/05/31 (月) 13:59:55 - aimar
いつも勉強させていただいています。

酵母を使った研究をしているのですが、BiFC法をmodifyした方法（？）で目的タンパク質の挙動を確認しようと考えています。
目的タンパク質は、細胞質に多く局在しており、ミトコンドリアやペルオキシソームにも局在しています（ただし既知のシグナルシークエンスは持っていません）。

目的タンパク質のミトコンドリアやペルオキシソーム局在の挙動を観察しようと考えています。

目的タンパク質に蛍光タンパク質をつなげた場合、functionalなタンパク質が作れなかったり、仮に出来たとしても細胞質に存在する目的タンパク質が光って、ミトコンドリアやペルオキシソームが確認できない状況です（細胞分画法を用いてミトコンドリアやペルオキシソームに局在することは確認しています）。

そこで、BiFC法を用いることを考えました。
私が考えた方法は以下の通りです。以下はペルオキシソームに局在する目的タンパク質の挙動を見る場合を書いています。

目的タンパク質-蛍光タンパク質のN末端半分（A）
蛍光タンパク質のC末端部分-ペルオキシソーム移行シグナル（PTS1）（B）

を付加したものをまず構築します（PTS1はC末端に存在するペルオキシソーム移行シグナルです）。

それらを発現させ、目的タンパク質がペルオキシソームに局在した時のみ蛍光が得られるようにできないかと考えています。

その際、（A）と（B）がペルオキシソーム内で相互作用しなければなりませんので、（A）と（B）にそれぞれ絶対に相互作用するタンパク質の相互作用領域（ここではタンパク質Aとタンパク質Bが相互作用するとします）を付加したものを使おうと考えいます。

タンパク質Aの相互作用に必要な領域-目的タンパク質-蛍光タンパク質のN末端部分
タンパク質Bの相互作用に必要な領域-蛍光タンパク質のC末端部分-ペルオキシソーム移行シグナル(PTS1)

この二つを発現させれば、目的タンパク質がペルオキシソームに局在する時のみ蛍光が観察できるのではないかと考えました。


そこで、タンパク質Aとタンパク質Bにはどのようなものをもちいればよいでしょうか。
出来る限り、強い相互作用で、かつ相互作用に必要な領域がわかっている代表的なもの（生物種は問いません）で皆様が知っていらっしゃるものがありましたら、ぜひ教えていただけないでしょうか。

よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2658-4 - 2010/06/04 (金) 16:41:37 - aimar
- ~様

ありがとうございます。
頭の中では、いけるんじゃないかと淡い期待を抱いていたのですが、難しそうですね。
なんとか蛍光タンパク質を使って、局在の変化等を見たいのですが......。

ウエスタン様
Duolink法、初めて知りました。
どんどんいろいろな解析手法が出てきますね。
こちらの方法についても可能かどうか考えてみます。

便乗 削除/引用
No.2658-3 - 2010/05/31 (月) 22:10:38 - ウェスタン
http://www.nacalai.co.jp/products/recommend/Duolink_in_situ_PLA_reagent.html

Ｔａｇつけて、Duolink、というのはいかがでしょう？
どなたか使われたかたいらっしゃいませんか？

(無題) 削除/引用
No.2658-2 - 2010/05/31 (月) 21:45:10 - ~
この方法でやるのであれば、2ハイブリッドでよくポジコンにされている、
p53とSV40 large T-antigenは候補の1つになると思います。
（この系で使い物になるか疑問ですが）

ただ、この方法で局在を示すところまでたどり着けるのか疑問なのですが。

１．タンパク質A、Bの局在に影響する可能性
２．細胞質にたくさん存在している目的タンパク質によって、”タンパク質B-蛍光タンパク質のC末-PTS1”がリクルートされてしまう可能性
３．逆に”タンパク質B-蛍光タンパク質のC末-PTS1”によって、目的タンパク質を含まない”タンパク質A-蛍光タンパク質のN末”がペルオキシソームにリクルートされる可能性
４．タンパク質Aの相互作用に必要な領域-目的タンパク質-蛍光タンパク質のN末端部分が当初の位置に局在できるのか
５．2つのコンストラクトが結合して、本当に蛍光が生じるか
など、不確定要素が多すぎると思います。

それらを1つずつ潰していくよりも、
低発現のプロモーターで発現させて、共焦点レーザー顕微鏡で観察したり、
酵母の電顕をやっているラボと共同研究にして、免疫電顕を依頼できないのでしょうか？

BiFC法を用いた局在解析 削除/引用
No.2658-1 - 2010/05/31 (月) 13:59:55 - aimar
いつも勉強させていただいています。

酵母を使った研究をしているのですが、BiFC法をmodifyした方法（？）で目的タンパク質の挙動を確認しようと考えています。
目的タンパク質は、細胞質に多く局在しており、ミトコンドリアやペルオキシソームにも局在しています（ただし既知のシグナルシークエンスは持っていません）。

目的タンパク質のミトコンドリアやペルオキシソーム局在の挙動を観察しようと考えています。

目的タンパク質に蛍光タンパク質をつなげた場合、functionalなタンパク質が作れなかったり、仮に出来たとしても細胞質に存在する目的タンパク質が光って、ミトコンドリアやペルオキシソームが確認できない状況です（細胞分画法を用いてミトコンドリアやペルオキシソームに局在することは確認しています）。

そこで、BiFC法を用いることを考えました。
私が考えた方法は以下の通りです。以下はペルオキシソームに局在する目的タンパク質の挙動を見る場合を書いています。

目的タンパク質-蛍光タンパク質のN末端半分（A）
蛍光タンパク質のC末端部分-ペルオキシソーム移行シグナル（PTS1）（B）

を付加したものをまず構築します（PTS1はC末端に存在するペルオキシソーム移行シグナルです）。

それらを発現させ、目的タンパク質がペルオキシソームに局在した時のみ蛍光が得られるようにできないかと考えています。

その際、（A）と（B）がペルオキシソーム内で相互作用しなければなりませんので、（A）と（B）にそれぞれ絶対に相互作用するタンパク質の相互作用領域（ここではタンパク質Aとタンパク質Bが相互作用するとします）を付加したものを使おうと考えいます。

タンパク質Aの相互作用に必要な領域-目的タンパク質-蛍光タンパク質のN末端部分
タンパク質Bの相互作用に必要な領域-蛍光タンパク質のC末端部分-ペルオキシソーム移行シグナル(PTS1)

この二つを発現させれば、目的タンパク質がペルオキシソームに局在する時のみ蛍光が観察できるのではないかと考えました。


そこで、タンパク質Aとタンパク質Bにはどのようなものをもちいればよいでしょうか。
出来る限り、強い相互作用で、かつ相互作用に必要な領域がわかっている代表的なもの（生物種は問いません）で皆様が知っていらっしゃるものがありましたら、ぜひ教えていただけないでしょうか。

よろしくお願いします。
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