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(無題) 削除/引用 No.2649-10 - 2010/05/30 (日) 16:12:36 - 井上 ほんとだ、 Dimethyl sulfoxide ≥99.7%, Hybri-Max™ というのと、 ポリエチレングリコール 溶液 Polyethylene glycol solution Hybri-Max™, 50 % (w/v) in 10% aqueous DMSO (v/v), がありました。DMSOの不純物が影響を与えるということですか。

(無題) 削除/引用 No.2649-9 - 2010/05/30 (日) 11:06:35 - TK-1 >[Re:7] 井上さんは書きました : > あべちゃんさんに便乗質問ですが、DMSO Hybri-MaxはどちらかというとPEGがメインで、細胞融合用の試薬です。DMSOの品質がそう違うとは思えないのですが、PEGが細胞の保存に有効ということなのでしょうか？ DMSO hybri-maxがPEGメイン？多分他のHybri-Max試薬と混同しているんじゃないですか。DMSO >99.7%です。 Hybri-Maxというのは個々の商品名でなく、Sigmaの試薬のgradeです。Hybri-Max PEGはPEGがメインで10%DMSOが入っています。

(無題) 削除/引用 No.2649-8 - 2010/05/30 (日) 01:26:07 - あかね みなさん、沢山のコメント有り難うございます。 至適してくださった点に注意して、もう一度トライしようとおもいます。 ちなみに、PEGがtransformationの効率を上げるという論文をみました。 An improved system for competent cell preparation and high efficiency plasmid transformation using different Escherichia coli strains その他にもコンピ作成に気をつける点等ございましたら、引き続きコメント宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2649-7 - 2010/05/29 (土) 23:27:32 - 井上 あべちゃんさんに便乗質問ですが、DMSO Hybri-MaxはどちらかというとPEGがメインで、細胞融合用の試薬です。DMSOの品質がそう違うとは思えないのですが、PEGが細胞の保存に有効ということなのでしょうか？

http:// 削除/引用 No.2649-6 - 2010/05/29 (土) 00:24:23 - TK-1 井上法ですが、modifyしています。 1. Streak on a LB(-) plate from stock and grow o/n. 2. Inoculate a single colony in 3 ml LB+20mM MgCl2, 37 degree o/n. 3. Dilute into 250 ml LB+20mM MgCl2 and incubate @18-22 degree until OD reaches 0.2-0.8. 4. Keep the flak on ice for 10 minutes and centrifuge in 50 ml conical @3000 rpm for 10 minutes, 0 degree. 5. resuspend (break pellets by tapping and gently mix without too much pipetting) in 80 ml of TB, keep on ice for 10 min. 6. Spin as above and resuspend in 20 m, keep on ice for 10 minutes. 7. Add DMSO (hybrimax) to 7%, dropwise. 8. Aliquot into pre-chilled tube and snap-freeze in LN2. 昔は１８度で２日間振っていましたが、こっちの方が時間がコントロールしやすいのと、結果が安定しているので、ここ２、３年はこれでやっています。LBでそのままできるので少し楽です。

(無題) 削除/引用 No.2649-5 - 2010/05/29 (土) 00:12:13 - ami DH5αですけど、10^9に迫るのが毎回作れます。 inoue法です。 ○ 集菌後は低温室で作業します(液体窒素は決して持ち込みません)。 ○ 集菌後はDecantした後もひっくり返したままにして、十分に上清を除いたあと、ふき取れるところはキムワイプでふきとります。 ○ 遠心機は2℃にしてます。 ○ Suspendするときにピペッティングせず、50mlチューブで振り続けてSuspendします。 ○ TF bufferは使用直前に毎回作成します。冷蔵庫でo/nとか、凍結保存とかしません。 ○ cooled TF bufferを冷蔵庫とか低温室じゃなくて氷冷にしてます。 ○ 分注用のチューブも、分注用のピペットも氷冷しておきます。 ● 分注後は液体窒素に投げ入れます（ぉ）。 くらいを気にするようにして、だいぶ効率上がりました。 ご参考まで。

DMSO 削除/引用 No.2649-4 - 2010/05/28 (金) 23:52:31 - あべちゃん Stbl2ではないのですが、井上法で作ったコンピの形質転換効率がぱっとしなくて、知り合いに相談したところDMSOを Sigma Cat.No. D2650 DMSO Hybri-Maxに代えたら？って言われて、代えてみたら上手くいったという経験があります。 関係ないかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.2649-3 - 2010/05/28 (金) 22:00:11 - あかね TKさん、 さっそくのご返事ありがとうございます。 なるほど、当方のInoue法に問題があるのかもしれませんね。 以下に、手持ちのプロトコルを貼付けました（読みにくくて、申し訳ないです）。 TKさんのプロトコルと違う点、注意点等ありましたら、教えていただけるとありがたいです。 Preparation of competent bacteria (Inoue method) Reagents * LB plate (Amp-) * DMSO * 1.5 ml tube (autoclaved) * SOB + Mg (200 ml x 3); Tryotone 4 g yeast extract 1 g NaCl 0.1 g KCl 0.037 g 2N NaOH 100 ul H2O to total 200 ml + 1M MgCl2 / 1M MgSO4 2 ml each * transformation buffer (TF buffer) 15 mM CaCl2 250 mM KCl 10 mM PIPES-KOH (pH6.7) + 55 mM MnCl2 (last step)--> filtration Protocol 00. Streak DH5a on LB (Amp-) plate and culture at 37°C o/n. 01. Pick up a single colony and culture it in 4 ml LB 37°C for 6 to 8 hrs. 02. Add 2, 1, or 0.5 ml of bacteria to each 200 ml of SOB (pre cooled at 18°C) . 03. Culture them at 18°C for around 36 hrs. 04. Measure its OD at 600 nm. Use SOB medium as a blank. One of 3 flasks must be around 0.6 of OD600. 05. Cool down a centrifuge at 4°C. 06. Transfer 200 ml culture medium to 4x 50 ml tubes 07. Centrifuge them at 3,000 rpm for 5 min at 4°C. 08. Discard the supernatant by decantation. 09. Suspend the pellet with 17 ml of cooled TF buffer for each tube. 10. Put them together into 2x 50 ml tubes and centrifuge at 3,000 rpm for 5 min 11. Wash the the pellet with 8 ml of cooled TF buffer. 12. Centrifuge at 3,000 rpm for 5 min 13. Re-suspend the pellet with 8 ml of cooled TF buffer again. 14. Add 600 µl of DMSO to each tube with gentle agitation. 15. Make 100 µl of aliquot in1.5 ml tube. 16. Put the tubes into liquid nitrogen (Do not through them). 17. Store them at - 80°C.

(無題) 削除/引用 No.2649-2 - 2010/05/28 (金) 21:25:23 - TK-1 年に何回かInoue法でStbl2やっていますが、5-10 x 10^7って感じで、特にDH5aと差は見られませんでした。何が違うんでしょうね？

自作competent cellの作り方 ; stbl2 削除/引用 No.2649-1 - 2010/05/28 (金) 21:20:16 - あかね 当方ではもっぱら自作でcompetent cell を作成しています。 現在、invitrogen社から販売されているStbl2のcompetent cellを自作できないかと思っています。 Inoue methodでtryしてみたのですが、1x10の６乗程度のcompetencyしか得られず、どうしようかと思っています。どなかたstbl2でコンピを自作された方いらっしゃったら、protocol等おしえていただけないでしょうか？ ちなみに、Inoue methodで、DH5a等のメジャーな株では、5x10の7乗 以上のcompetencyを得ることができています。 invitrogenのstbl2の添付書類を見てみると、ルビジウムを使ったHanahan法を改変して作成しているようでした。このルビジウムを使用したprotocolは試したことがないのですが、Inoue法と比べて効率の良いコンピが得られるのでしょうか？どなたか経験のあるかた、感想をお聞かせください。

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