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(無題) 削除/引用 No.2642-8 - 2010/05/28 (金) 11:57:44 - ~ Ratioは別問題と言うのには同意しますが、他の部分で。 >Trizolに溶解直後、4℃で1日放置した場合 その冷蔵保存方法は何を根拠に行なっているのでしょうか？ Trizolのマニュアルだと、 After homogenization and before addition of chloroform, samples can be stored at -60 to -70°C for at least one month. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/15596018%20pps%20Trizol%20Reagent%20061207.pdf と書かれていますので、貴方が異なる保存法を選択している以上、 貴方はその方法でも問題ないことを何かで確認しているはずだと思いますが。 何か文献があれば、問題ないのでしょうし、 貴方に教えた先輩がその方法で取れていたのであれば、保存法自体が致命的な問題ではないのでしょう。 また、保存方法が気になるのでしたら、同じサンプルを2つに分けて、 片方を-80℃、もう一方を冷蔵保存すれば、確認できますよね。 1年経っているのであれば、どこかでやる機会があったと思いますけど。 >その純度の低いRNAからcDNAを合成しPCR後の電気泳動では、バンドがプライマーとは別に非特異的に何本も出ます。 ゲノムDNAのコンタミや、プライマー、PCR条件が悪いほうが疑わしいと思いますけど。 他の人の抽出したRNAや、他の人が合成したcDNAと並べて比較すれば、 どのステップに問題があるのかは分かるのでは。 マニュアルどおりに操作して、 >他のうまい人 に使用済みのサンプルを貰って、 電気泳動、吸光度、PCRを使ってどのステップに問題があるのかを同定するのが、解決への早道だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2642-7 - 2010/05/28 (金) 11:10:28 - Pumpkin >RNAを抽出し始めて、1年経ちますが、未だに純度が低いものしかとれず ウさんがおっしゃているように、「純度」と「分解の程度」はパラレルではありません。純度は吸光でみていると思いますが、分解の程度は電気泳動でしかみることができません。蛋白質の混入と(260/230が低ければ)TRIzol試薬の混入が考えられるので、それらが混入しないようにマニュアル通りに正確にやることを心がけましょう。ウさん、AOrDさんがおっしゃるように、中間層をとってしまうとイソプロ沈で共沈してきますのでそのあとのぞけません。酸性フェノールやTRIzole処理を繰り返すというのも手です。 >Trizolに溶解直後、4℃で1日放置した場合、RNAの分解が進み、 TRIzolによるRNase失活がうまくいっていれば酵素学的RNA分解は抑えられるはずですが、できればその日の内にRNAにまで精製した方がいいと思います。そもそもマニュアルにはTRIzolでホモジナイズした後に保存する場合には−60℃〜70℃で保存するように記載がありますが、マニュアルは熟読しているのですか？ >その純度の低いRNAからcDNAを合成しPCR後の電気泳動では、バンドがプライマーとは別に非特異的に何本も出ます。 これは、本当に純度の低いRNAに起因しているのですか（もちろん、そういう場合もあると思います）？純度が高いRNAから出発した場合には必ずシングバンドを与えるような系だという確認があるのですよね？RNAの純度と分解については、例えばアジレントのbioanalyzerについてのテクニカルノートなんかを参考にすると理解が進むかもしれません（AmbionのHPとかでもなんでもいいです）。

(無題) 削除/引用 No.2642-6 - 2010/05/28 (金) 00:44:16 - AOrD すみません。中間層から余裕をとって、というのは上清を回収する時にぎりぎりまで吸わずに、中間層から距離を保って回収する、という意味です。誤解を招いてはいけませんので訂正してお詫び申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2642-5 - 2010/05/28 (金) 00:42:22 - AOrD 純度が低いことに関しては中間層やフェノール層からのコンタミの様に思われます。私も以前RNA純度で悩んだことがありましたが、上清をもう一度遠心にかけて上清の上清(ややこしい?)をクロロホルム以降の処理に進める様にしてから純度が安定する様になりました。邪道かも知れませんが。。 RNA量が多い様であれば、中間層から余裕をとって回収するのも手だと思います。 ちなみにサンプル数は一度にいくつ位ですか?手技に自信を持って出来る様になるまでは、一度に6サンプル程度で全体のプロトコールを通してやって、少しずつサンプル量を増やしていくのもいいかと思います。 純度とは関係ないかも知れませんが、Trizol処理後保存するのであれば4℃よりも-80℃の方がいいかも知れません。室温で5分程度放置した後に、ですが。

(無題) 削除/引用 No.2642-4 - 2010/05/27 (木) 22:18:24 - ウ >今まで、私は細胞をTrizolで溶解後、冷蔵庫(−4℃)で1日置いて、次の日にそれ以降のクロロホルムを加えて、分離層をとっていました。 ここがratio 1.2を説明するのには考え難いかなと思います。 ratioが低いという事は、分解云々はあまり関係がないと思いますが。 ratioが低くなる原因としてはタンパク質のコンタミでしょう。 あるいは、クロロホルムを加えた後の遠心で上清を回収するとき、欲張りすぎてタンパクや中間層を取ってしまう時とかに？

(無題) 削除/引用 No.2642-3 - 2010/05/27 (木) 20:56:40 - kodama 可能性はあると思います。 私はＩＳＯＧＥＮ派ですが−８０度保存にしています。 あとは、推奨プロトコールを守らずに、組織量・細胞量を欲張って取ると変性剤が作用しきらずに失敗するという話を聞いたことがあります。 ＞一番低いときには純度が1.2台となります。 取れていないことは明らかなようですが、私は逆転写に進む前に、分解のないＲＮＡが取れているかどうかのチェックとして、アガロースゲル電気泳動をしてrRNAを見ています。 このチェックをクリアしたサンプルのみを次の作業に進めています。

RNA抽出　Trizol溶解後の保存方法 削除/引用 No.2642-1 - 2010/05/27 (木) 18:24:37 - 教えてください はじめまして。 私は動物細胞をTrizolによって溶解し、その後、フェノール・クロロホルム抽出法によって、RNAを抽出しています。 RNAを抽出し始めて、1年経ちますが、未だに純度が低いものしかとれず、一番低いときには純度が1.2台となります。 そこで、もう一度プロトコールを確認したり、他のうまい人のやり方をみたりしたところ、私が失敗していたのは、細胞をTrizolで溶解後−80℃で保存していなかったためでないかと思いました。 今まで、私は細胞をTrizolで溶解後、冷蔵庫(−4℃)で1日置いて、次の日にそれ以降のクロロホルムを加えて、分離層をとっていました。 Trizolに溶解直後、4℃で1日放置した場合、RNAの分解が進み、最終的にRNAの濃度を測定したときには純度が低くなるのでしょうか？あと、全体的にRNAの抽出操作をすばやくしたほうがいいということも考えました。 ちなみに、その純度の低いRNAからcDNAを合成しPCR後の電気泳動では、バンドがプライマーとは別に非特異的に何本も出ます。 RNAの純度が低い理由は何でしょうか？

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