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耐熱性の高いPCRの酵素について トピック削除
No.2637-TOPIC - 2010/05/27 (木) 13:17:13 - PCRビギナー
少量のテンプレート（数コピー）からの遺伝子増幅を試みており、多数のサイクルでもへたりにくいPCR酵素を探しています。
２回PCRをすれば良いのではという意見もありますが、コンタミの危険を軽減する為に一回仕掛けたら最後までふたを開けたくないので１回で増幅したいです。具体的には６０−８０サイクル程度を考えています。

どの会社のどの酵素が良いよ、など情報がありましたらご教授下さい。
　
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(無題) 削除/引用
No.2637-6 - 2010/05/28 (金) 17:06:54 - う
実際に、その数コピーとやらから通常のPCRをやってみて本当にバンドが出ないのか？
まずはこれを確認するのはどうでしょうかね。

そして、それと同時に、

単純にサイクル数を増やせばいいのか？ということを考えてみてはいかがでしょう。

サイクル数を増やせばいいという考えの裏には、他の条件は完璧であるという絶対の自信があるということになりますが、本当に他の条件が完璧とどうして言えるのでしょうか？

＞２回PCRをすれば良いのではという意見もありますが、コンタミの危険を軽減する為に一回仕掛けたら最後までふたを開けたくないので１回で増幅したいです。

数コピーの増幅を行なおうとしている人が、この程度でのコンタミを恐れているようでは
最初の反応液を作る際のハンドリングには自信があるというのもおかしな話。

最初っから、６０−８０サイクルのPCRをしなくてはダメだと決めてかかっている、凝り固まった考え方をしているようで、私は違和感を感じます。

他の方の素晴らしい書き込みを見て考えてみて下さい。
PCRビギナーであるのなら、まずは基本を押さえましょう。

(無題) 削除/引用
No.2637-5 - 2010/05/28 (金) 14:07:09 - in situ
一応サイクルによるコピー数を概算してみますと、1コピーのものを60サイクルPCRにかけて、1サイクル当たり2倍になるとすれば、おおよそ10^18コピーの産物が生成することになります。

1000塩基の領域を増幅しているとして、1塩基当たりの分子量を370として概算すると、

370×1000×10^18/(6*10^23)=0.6g

です。多すぎです。

ちなみに、40サイクルの場合はおおよそ0.6ug。
これだって、電気泳動で見えないレベルではないと思います。

したがって、40サイクルで見えないというのはコピー数の問題ではなく、逆転写効率もしくはPCRの増幅効率が非常に悪いためということになります。

ですから、atsさま、~さまのおっしゃるようにPCRの条件をいじって40サイクルで見える条件を見つけることの方が理にかなっていると思います。

(無題) 削除/引用
No.2637-4 - 2010/05/28 (金) 12:45:43 - ~
質問文からは、現在の技術、製品を調べた上で、報告がないことに挑戦しようとしているのか、
何も考えずに丸投げしているのかが分からないのですが。

テンプレートは一分子未満では無いのですよね。
一分子PCRは、10年以上前から研究されていて、
PubMedでも数十報は登録されていますが、
それらの情報は参考にならないのですか？

既に市販品は全て調べていますよね。
適当に耐熱性ポリメラーゼで検索したら、
http://roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.6.17.2.3.1.html
というのがヒットしましたけど、これでは不足ということでしょうか？

サイクル数だけはdenatureの長さや温度は決まりませんので、
サイクル数での規格というのはないと思います。
時間や条件で言うとどのような規格の製品を求めているのでしょうか？

要再考 削除/引用
No.2637-2 - 2010/05/28 (金) 11:52:22 - ats
レスが付かないようなので、老婆心から...
60サイクルも回さなければ増幅が見られないPCR条件は、primer配列と鋳型配列、試料の純度、反応条件等になんらかの大きな問題があると考えられますが、問題点の切り分けあるいは条件決めが出来ているのでしょうか。
増幅効率が悪くても40サイクルぐらいが試行の上限あたりかなと思います。それ以上のサイクルで増えてくる産物は必ず目的産物か否か他の方法で確認する必要があるでしょう。
先人はNested PCRという２段階のPCRで特異性(コンタミの回避にもなる）と増幅効率を両立する方法を開発しています。コンタミを防ぐ手法は過去のトピックを探してください。
サンプル数がとても多いため、操作を減らしたいのしょうか。それならなおのこと再現性のためにもＰＣＲ条件の至適化が重要になります。
指導者と実験手法について相談・再考することをお勧めします。

耐熱性の高いPCRの酵素について 削除/引用
No.2637-1 - 2010/05/27 (木) 13:17:13 - PCRビギナー
少量のテンプレート（数コピー）からの遺伝子増幅を試みており、多数のサイクルでもへたりにくいPCR酵素を探しています。
２回PCRをすれば良いのではという意見もありますが、コンタミの危険を軽減する為に一回仕掛けたら最後までふたを開けたくないので１回で増幅したいです。具体的には６０−８０サイクル程度を考えています。

どの会社のどの酵素が良いよ、など情報がありましたらご教授下さい。
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