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(無題) 削除/引用 No.2636-9 - 2010/05/31 (月) 13:29:22 - JH 悩ましい問題だと思います。 解決法を提案することはできませんが、下記の件についてご参考までに。 > ２色を両方とも蛍光で染めようと考えていましたが、Alexa647と酵素抗体法の > 組み合わせも良さそうに思います。 黒い色素は基本的にどんな波長の光も吸収してしまいますので、酵素抗体法で発色させた色素が蛍光の光を吸収してしまうことがあります。そのため、酵素抗体法の色素が黒いほど、co-localizationが見づらくなります。細胞内の局在が異なれば、何とかなることもあります。

(無題) 削除/引用 No.2636-8 - 2010/05/31 (月) 12:26:44 - mouse 肝臓での経験はありませんが、陰性コントロールを同じisotypeで染めたりしてしっかり判別しようとしても自家蛍光や非特異的反応と区別しづらいことがあります。 通常の免染やFACS等の結果を組み合わせて総合的に判断しなければいけないことも多々あります。 DCやマクロファージは確かに自家蛍光が高いですね。

(無題) 削除/引用 No.2636-7 - 2010/05/31 (月) 12:04:16 - ぽー DCさんありがとうございます。 強い蛍光のそれぞれの大きさがちょうど細胞ぐらいの大きさなのと 場所からするとDCさんの言われている通りかもしれません。 ただ肝臓の専門家ではないので今の時点ではちょっとはっきりとは 分かりませんが。 でも、もしクッパー細胞が原因だとしたらブリーチングなどを 試さないかぎり対処困難かもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.2636-6 - 2010/05/31 (月) 11:10:31 - DC 解決方法でもなんでもないですが、マクロファージ（肝臓ではクッパー細胞）はとんでもなく自家蛍光が高いと聞いた事があります。

(無題) 削除/引用 No.2636-5 - 2010/05/31 (月) 05:25:07 - ぽー 皆様アドバイスどうもありがとうございます。 細胞の蛍光染色はずっとやっているのですが、組織サンプルの染色経験は ほとんどないので思っていたよりも大変だと感じてます。 酵素抗体法は確かに現在の私の問題を簡単に解決してくれるだろうと思います。 ただ２重染色の経験はないのですが、ひとつの細胞が両方のカラーで染まった場合に それぞれのカラーの感度はどのような感じになるんでしょうか？ つまり、片方のカラーで染まるともう１色が染まっているかどうかがどれくらい 容易に判定できるか、ということです。 このあたりは色の組み合わせや、染める順番などで十分対処可能でしょうか？ あとAlexa647は試していませんが、行けるだろうと思います。 ２色を両方とも蛍光で染めようと考えていましたが、Alexa647と酵素抗体法の 組み合わせも良さそうに思います。 未固定サンプルから切片を作って未固定の状態で観察してみましたが、だいぶましなものの まだ若干自家蛍光が残っているので、蛍光染色のみで押していくのは難しいのかもしれません。 他にも詳しい方で何かアドバイスありましたらコメントいただけると幸いです。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2636-4 - 2010/05/29 (土) 16:55:15 - toyo 生物由来の自家蛍光は一般に近赤外領域で減弱するらしいので、Alexa 647などの使用を検討されていはいかがでしょうか。 過去ログでも自家蛍光の話題はいくつかあったと思いますので、検索されてみるとよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2636-3 - 2010/05/28 (金) 20:28:30 - Boston 私の場合、固定の時間を短くしました。卵巣ですが、on ice で１５分です。ポイントは組織片を極力小さくすることで、固定の時間を短くすることです。肝臓で work するか分かりませんが。

(無題) 削除/引用 No.2636-2 - 2010/05/28 (金) 20:20:55 - 通りすがり 解決法ではないので申し訳ありませんが、 ここ数年蛍光が流行しているので 組織切片でも蛍光の写真が時々見られますが 自家蛍光は大きな問題だと思います。 陽性となるべき場所以外でもぼんやり光りますからね。 基底膜とか弾性線維とかその他… 私は何回かやってみて 組織切片では酵素抗体法（明視野）での2重染色の方で いいのでは判断しました。 現在は茶、青、赤、緑色などありますし 陽性部位や非特異反応とかも判定しやすいです。 培養細胞なら蛍光染色は効果的ですが。 このあたりは目的抗原の分布部位や 発現量とかも関わってくるかもしれません。 良い方法が見つかると良いですね。

肝臓の蛍光免疫染色での自家蛍光 削除/引用 No.2636-1 - 2010/05/27 (木) 13:06:04 - ぽー 肝臓のfrozen sectionで蛍光免疫染色を試していますが自家蛍光で困っています。４パーセントPFAで固定後に切片を作製し、未染の状態でも蛍光顕微鏡下でおそらく類洞のあたりに肝細胞と同じくらいの大きさのdotが多数見られます。これはgreen、redの両方のチャネルで検出されます。 文献等を参考にPFAの濃度を下げる、固定時間を短くする、アセトン固定に変えてみる、切片作製後に固定、などを試そうかと思っていますが、どなたか詳しい方がおられましたらアドバイスいただけないでしょうか。 また、これは何からの蛍光なのでしょうか？Bright fieldでも対応する箇所に特別なものはなさそうに見えるのですが。 使用する抗体の関係でfrozen sectionで切片を作製し、その後に２重染色をしたいので何とか蛍光染色ができるように自家蛍光の問題を解決したいと思っています。 よろしくお願いいたします。

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