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(無題) 削除/引用 No.2620-11 - 2010/05/31 (月) 20:33:33 - リプローブしたい 皆様 回答ありがとうございます。 とても勉強になります。 実験が進みましたら改めてリプローブ結果を報告させていただきます。

そうです 削除/引用 No.2620-10 - 2010/05/31 (月) 17:14:32 - GB250 その普通のストリッピングバッファーで、室温20分です。 私は10ml使って、普通にタッパーで20分振っているだけです。 出来合いのはお金が勿体なくて買ったとはありませんが、自作の普通ので上手くいかなかった事もありませんし、困ったことも1度もありません。 抗体は弱いのから順に当てていき、最後にinternal controlを染めれば、私は平均5 blot/membrane位は焼いてます。

(無題) 削除/引用 No.2620-9 - 2010/05/31 (月) 12:58:47 - TS よこやりで恐縮ですが、教えてください。 ＞ウェスタン後のリプロービングは室温で問題なくできてます そうなんですね。 これって、良く使用される、Tris(62.5mM), SDS(2%), b-ME(100mM), pH6.8のストリッピングバッファーでしょうか（多少の組成の違いはあるかもしれませんが）。いつも、50℃、30分でやっていましたが、室温でもはがれるのですね？ 室温でのインキュベーション時間は、30分くらいでしょうか？ Glycine (0.4M), SDS(0.2%), Tween20(2%), pH2.2とかの、ストリッピングバッファーもよく使うんですが、室温、１時間のインキュベーションでは、一次抗体まではちゃんとはがれないことが多くて、こちらは２次抗体種が違うときに使っています。 それと、もしご使用経験がある方がおりましたら、教えてください。市販のストリッピングバッファー（例えば、ピアースのレストアシリーズ、下記リンク）などは、やはり自作よりも優れているのでしょうか？　まぁまぁ安いし、試しても良いかな、と思ったり。 http://www.thermoscientific.jp/bid/pierce/immunodetection/western-blotting/restore-plus.html

(無題) 削除/引用 No.2620-8 - 2010/05/29 (土) 21:24:33 - 名無し ウェスタン後のリプロービングは室温で問題なくできてます。

アジ化ナトリウムは 削除/引用 No.2620-7 - 2010/05/29 (土) 17:37:07 - GB250 確か可逆的だったはず。 だからWashしてる間に復活しますよ。 私は最近は、高温じゃなくて室温でリプローブしています。高温は、メンブレン上のタンパクをがっつり持って行くので、シグナルが弱くなりますよ。 室温で20分も処理すれば、メンブレン上のタンパクをあまり減らさずに抗体だけ取ることが出来ます。その後1分ｘ３回洗って、２０〜30分リブロッキングすれば、直ぐに別の抗体で染められます。

(無題) 削除/引用 No.2620-6 - 2010/05/29 (土) 05:48:53 - 通りがかり もう解決したかもしれませんが、 GEのHPに過酸化水素水を使ったHRPの不活性化方法が載っています。 過去に試したことがありますが、一応workしました。 右下のアプリケーションノートの項目を参照して下さい。 http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/ecl/index.asp

(無題) 削除/引用 No.2620-5 - 2010/05/26 (水) 19:57:03 - リプローブしたい うぇすたん 様 教えていただきありがとうございます。 とても勉強になりました。 ぜひ、試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2620-4 - 2010/05/24 (月) 09:35:31 - うぇすたん アジ化ナトリウムは終濃度0.02%で使っております。 失活しているかどうか気になるようでしたら、 10分後とか20分後に検出液かけて確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2620-3 - 2010/05/23 (日) 11:35:08 - リプローブしたい うぇすたん 様 早速の回答をありがとうございます。 恐れ入りますが、使用する際のアジ化ナトリウムの濃度を教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

できますよ 削除/引用 No.2620-2 - 2010/05/23 (日) 02:52:57 - うぇすたん ただし、サイズが近い場合などは二次抗体の種類が違わないとクロスしちゃうので無理ですが。例えばポリ（ウサギ）で検出した後に、HRP失活させ、モノ（マウス）で見るとかはいつもやってます。 うちでは検出後、アジ化ナトリウム入りのTBSで10分ぐらい洗って、そのまま次の一次抗体処理に入ります。 最近はHRPのついた抗体（タグ抗体はほぼそろいます）もありますので、そういうものを使えば楽勝です。まあ二回目以降、バックが高くなる傾向があります（もちろん抗体次第）

WB：HRPを失活させれば抗体を剥がさずリプローブできる？ 削除/引用 No.2620-1 - 2010/05/22 (土) 23:01:20 - リプローブしたい いつも勉強させていただいております。 ウエスタン解析のリプローブに関する質問です。 ウエスタンで一度使用したPVDFメンブレンをリプローブバッファー（SDSや2MEが入ったバッファーで50℃30分）で洗うことにより 抗体を落とすという方法はさまざまなテキストで見たことがあります。 実際に私もこの方法を取ることがありますが、どうも私の実験系ではシグナルが弱くなってしまうようです。 しかし最近、「メンブレンに残っているHRPを失活させてしまえば抗体をはがす必要はない。別の抗体で解析することができる」 という話をネットで見かけました。 URLを控えていなかったため、詳細が不明です。検索しなおしてもヒットせず困っております。 もしこの方法をご存知でしたら教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

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