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FACSでのHoechstとの共染色 トピック削除
No.2616-TOPIC - 2010/05/22 (土) 07:52:40 - gs86
いつも勉強させていただいております。

今回、マウスのある組織から幹細胞を集めるために、live cellの状態でHoechst33342とPIでside population (SP)をとってこようと考えています。さらにその集団を2つに分けるため、いくつかの抗体で染めてからsortingしたいのです。

FACSの経験はまあまあありますが、SPをとるのは初めてなので、プロトコールをwebで探してみたのですが、Hoechstを入れてから37度で30−60分incubateして、PIを加えてそのまま洗わずにソーターへ直行、というようなのが多いように感じています。残念ながら、その他の抗体をどのタイミングで加えて染色すればいいのかがわかりません。普段は4度20−30分で染色するようなFACS用の抗体です。Hoechstの前に染色すべきか、同時染色可能か、どっちでもいいのか。

洗浄の可否、incubation用のバッファーの組成なども含め、経験者の方おられましたが、アドバイスお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2616-2 - 2010/05/22 (土) 07:56:39 - gs86

> 経験者の方おられましたが、アドバイスお願いいたします。

「経験者の方おられましたら、アドバイスお願いいたします。」

すみません。。。

FACSでのHoechstとの共染色 削除/引用
No.2616-1 - 2010/05/22 (土) 07:52:40 - gs86
いつも勉強させていただいております。

今回、マウスのある組織から幹細胞を集めるために、live cellの状態でHoechst33342とPIでside population (SP)をとってこようと考えています。さらにその集団を2つに分けるため、いくつかの抗体で染めてからsortingしたいのです。

FACSの経験はまあまあありますが、SPをとるのは初めてなので、プロトコールをwebで探してみたのですが、Hoechstを入れてから37度で30−60分incubateして、PIを加えてそのまま洗わずにソーターへ直行、というようなのが多いように感じています。残念ながら、その他の抗体をどのタイミングで加えて染色すればいいのかがわかりません。普段は4度20−30分で染色するようなFACS用の抗体です。Hoechstの前に染色すべきか、同時染色可能か、どっちでもいいのか。

洗浄の可否、incubation用のバッファーの組成なども含め、経験者の方おられましたが、アドバイスお願いいたします。
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