私は、遺伝子を扱う研究室に所属する修士課程の学生です。
RACE法を用いて既知の遺伝子のアイソフォームの同定を試みているのですが、
知識・経験不足で自力で解決出来ない問題に出くわしました。
この分野に詳しい方、恐れ入りますが、力を貸して頂けませんか?
質問は4つあります。1つでも良いので、教えてください。
どうか、宜しくお願い致します。
(非常に初歩的な質問かも知れませんがお許し下さい。)
(以下、具体的なトラブルの内容)
●5'RACEにて
【既知の遺伝子のcDNA】
5'-(UTR)(開始コドン)(遺伝子配列)(終止コドン)(UTR)(ポリA)-3'
【5'RACE法で釣り上げたcDNA】
5'-(NUPの配列)(既知の遺伝子配列の途中からの配列)(既知の遺伝子に特異的なプライマーの配列)-3'
5'RACE法で釣り上げたcDNAについて、
可能性A…上流にあるエクソンが欠けたmRNAのバリエーションである。
可能性B…RACE用のcDNAを作る際にRTが途中で止まり、不完全なcDNAを釣ってきただけである。
《質問1》
可能性AとBを見分けるポイントを教えてください。
(他の可能性がある場合は、それも含めた見分け方を教えてください)
●3'RACEにて
【既知の遺伝子のcDNA】
5'-(UTR)(開始コドン)(遺伝子配列)(終止コドン)(UTR)(ポリA)-3'
【3'RACE法で釣り上げたcDNA】
5'-(既知の遺伝子に特異的なプライマーの配列)(既知の遺伝子の配列)(既知の遺伝子には無い配列約100bp)(既知の遺伝子の配列約70bp)(既知の遺伝子には無いTやAを多く含む配列約200bp)(ポリA)-3'
※ポリAが付いている位置は、既知の遺伝子のcDNAの全長の半分くらいのところです。
《質問2》
3'RACE法で釣り上げたcDNAは、mRNAのバリエーションと考えてよろしいでしょうか?
《質問3》
3'RACE法で釣り上げたcDNAについて、既知の遺伝子には無い配列約100bpは、GTで始まりAGで終わらないため、イントロンではないと考えられます。
しかし、この配列あたりのみゲノム解析をしたところゲノムの配列中にもこの配列が見当たらないため、エクソンでもない気がします。これの正体を教えてください。
《質問4》
RACE法のトラブルシューティングを調べたところ、
「異なる複数のポリアデニル化部位の使用により、複数の3'RACE産物が出来る」と書いてありました。
“異なる複数のポリアデニル化部位の使用”という表現がよくわかりません。
初歩的な質問ですが、どうかご教授ください。
(自分なりに調べたのですが、理解するのが困難でした。) |
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