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5'RACEおよび3'RACEでのトラブル 削除/引用 No.2615-8 - 2010/05/28 (金) 16:23:24 - nyamo 回答ありがとうございます。 > >同時期ではありませんが、買い付け先は同じです。 > > これが遺伝的バックグラウンドが同じだということを証明する手立てにならないことは、認識されていた方が良いと思いますよ。エビに詳しいわけではないので、よくわかりませんが、マウス等の実験動物のように実験用に遺伝的バックグラウンドが保障されたエビではないのでしょう？（もし、遺伝的バックグラウンドが保障されているとしたら、無視してください） 遺伝的バックグラウンドの保障についてはわかりかねます。 mRNAのバリエーションを探していく上で今回のようなトラブルが多発するようであれば、遺伝的バックグラウンドについて一度担当教官と相談したいと思います。 > >mRNAのバリエーションなのか、それとも、RACEで起こる単なるトラブル > > アーティファクトかどうかはあなたが設定した遺伝子特異的プライマーから新規配列までの既知配列がしっかりと増幅されているかが重要です。既知配列の5'-RACEをするときに5'端ぎりぎりにアンチセンスプライマーを設計するとか、3'-RACEをするときに3'端ぎりぎりにセンスプライマーを設定するとかしてしまうと、それがノンスペシフィックな増幅かどうか判断できません。これはマニュアルに書いてあると思います（私もclontechのRACE kit愛用してます）。 了解致しました。マニュアルを読み直してみます。 > そもそも5'-RACEでエクソンの欠落とあったかと思いますが、得られた配列には開始コドンがあるのですか？また、翻訳アミノ酸をアライメントしてみてBlastの結果などから考察すると良いと思います。 開始コドンはあります。 早速Blastで検索かけてみます。 RACEでのトラブルについて詳しく教えて頂き、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2615-7 - 2010/05/27 (木) 11:25:10 - Pumpkin >同時期ではありませんが、買い付け先は同じです。 これが遺伝的バックグラウンドが同じだということを証明する手立てにならないことは、認識されていた方が良いと思いますよ。エビに詳しいわけではないので、よくわかりませんが、マウス等の実験動物のように実験用に遺伝的バックグラウンドが保障されたエビではないのでしょう？（もし、遺伝的バックグラウンドが保障されているとしたら、無視してください） >mRNAのバリエーションなのか、それとも、RACEで起こる単なるトラブル アーティファクトかどうかはあなたが設定した遺伝子特異的プライマーから新規配列までの既知配列がしっかりと増幅されているかが重要です。既知配列の5'-RACEをするときに5'端ぎりぎりにアンチセンスプライマーを設計するとか、3'-RACEをするときに3'端ぎりぎりにセンスプライマーを設定するとかしてしまうと、それがノンスペシフィックな増幅かどうか判断できません。これはマニュアルに書いてあると思います（私もclontechのRACE kit愛用してます）。 そもそも5'-RACEでエクソンの欠落とあったかと思いますが、得られた配列には開始コドンがあるのですか？また、翻訳アミノ酸をアライメントしてみてBlastの結果などから考察すると良いと思います。

5'RACEおよび3'RACEでのトラブル 削除/引用 No.2615-6 - 2010/05/26 (水) 23:25:11 - nyamo 回答ありがとうございます。 > >異なるサンプルを用いました。（両者の差はエビの個体差ということになります。） > > これだと、ゲノムを調製した個体のゲノム配列と、cDNAを調製した個体のゲノム配列は違う可能性が拭えませんよね。クローンであればいいですが、どのようなpopulationのエビなのかわかりませんが。その辺はいかがでしょうか。 同時期ではありませんが、買い付け先は同じです。 （買い付け先の業者が養殖したエビです。天然物ではありません。） > >ORFは保たれていません。 > > いや、挿入配列によって終止コドンが入るとかでなくて、機能性のある蛋白として翻訳されるのならmRNAのバリエーションということでいいのではないですか？だいたいSMARTのRACEで取ってきているのでイントロンを拾うということはないのではないですか（まぁ、絶対にないといいませんが、DNase 処理したRNAとSMARTでやればさらに良いですが）。 機能性があるかどうかは、今後調べる予定です。 今の段階で、mRNAのバリエーションなのか、それとも、RACEで起こる単なるトラブル(例えば5'RACEにみられるアーチファクトなど)なのかを判断できないかが気になって質問させて頂きました。

(無題) 削除/引用 No.2615-4 - 2010/05/26 (水) 00:06:40 - Pumpkin >polyA付加シグナルが見つからなかった場合、シーケンスの読み間違いでしょうか？ poly A付加シグナルはコンセンサス配列があることはありますが、例外というかそれ以外の配列によることも多いので「見つからなかった」というのは的確な表現ではないと思います。現にpoly Aが付加されているのですから。 >異なるサンプルを用いました。（両者の差はエビの個体差ということになります。） これだと、ゲノムを調製した個体のゲノム配列と、cDNAを調製した個体のゲノム配列は違う可能性が拭えませんよね。クローンであればいいですが、どのようなpopulationのエビなのかわかりませんが。その辺はいかがでしょうか。 >ORFは保たれていません。 いや、挿入配列によって終止コドンが入るとかでなくて、機能性のある蛋白として翻訳されるのならmRNAのバリエーションということでいいのではないですか？だいたいSMARTのRACEで取ってきているのでイントロンを拾うということはないのではないですか（まぁ、絶対にないといいませんが、DNase処理したRNAとSMARTでやればさらに良いですが）。

5'RACEおよび3'RACEでのトラブル 削除/引用 No.2615-3 - 2010/05/25 (火) 01:52:13 - nyamo 回答ありがとうございます。 > >《質問1》 > >可能性AとBを見分けるポイントを教えてください。 > > これは、そんなに簡単なことではありません。得られた新規配列からプライマーエクステンションを行ったり、再度RACEを試みたりして上流部を得ようとすることが一般的かと思います わかりました。再度RACEを試みてみます。 > >《質問2》 > >3'RACE法で釣り上げたcDNAは、mRNAのバリエーションと考えてよろしいでしょうか？ > >《質問4》 > >RACE法のトラブルシューティングを調べたところ、 > 「異なる複数のポリアデニル化部位の使用により、複数の3'RACE産物が出来る」 > > 質問2と4の内容は同じだと思うのですが、polyAはpolyA付加シグナルより後ろにつきますが、色々なバリエーションがあります。これはよく観察される事例です。「異なる複数のポリアデニル化部位」というのはそのままの意味で、複数のpolyA付加サイトがあることです。一つの遺伝子であっても転写開始点もいくつも存在するので、一つの遺伝子において一つの転写開始点と一つのpolyAサイトというように決まった形だけが存在するわけではありません。 polyA付加シグナルが見つからなかった場合、シーケンスの読み間違いでしょうか？ > >《質問3》 > >3'RACE法で釣り上げたcDNAについて > > ゲノム解析を行ったとありますが、あなたがmRNAを調製したサンプルとゲノムを調製したサンプルは同じですか（ゲノムだけ公共DBとかいうことはないですか）？ 異なるサンプルを用いました。（両者の差はエビの個体差ということになります。） とあるエビの全臓器をプールしたサンプルからゲノムおよびmRNAの抽出を行ないました。 >挿入配列にがあってもORFが保たれるとか、そういった確認は既におこなっていますよね。 ORFは保たれていません。 あるドメインのみ所有している形になっています。 ただ、このような不完全なORFは、昆虫でも見つかっているようで、 その論文にはmRNAのバリエーションと記載されていました。 > それからNUPとか言われても、あなたがどこの製品を使っているのか開示が無いので何の配列なのかさっぱりわかりません（まぁ、ある程度わかりますが、自分だけわかっていてもだめですよってことです。） 記載を失念しており、申し訳ありませんでした。 SMART TM RACE cDNA Amplification Kit (Takara)の　Nested Universal Primer A (NUP)です。

(無題) 削除/引用 No.2615-2 - 2010/05/24 (月) 10:23:16 - Pumpkin >《質問1》 >可能性AとBを見分けるポイントを教えてください。 これは、そんなに簡単なことではありません。得られた新規配列からプライマーエクステンションを行ったり、再度RACEを試みたりして上流部を得ようとすることが一般的かと思いますが、得られた新規5'端上流配列で開始コドンが見つかり、かつそれより上に終止コドンが見つかれば転写開始点の異なる愛想フォームという可能性もあるかもしれません。開始コドンが見つからない場合には可能性Bが考えられます。いずれにしてもRACEだって完璧でないし、cDNA合成までのところで、どれだけ気を使って実験しているかも多大な影響をあたえるでしょう。 >《質問2》 >3'RACE法で釣り上げたcDNAは、mRNAのバリエーションと考えてよろしいでしょうか？ >《質問4》 >RACE法のトラブルシューティングを調べたところ、 「異なる複数のポリアデニル化部位の使用により、複数の3'RACE産物が出来る」 質問2と4の内容は同じだと思うのですが、polyAはpolyA付加シグナルより後ろにつきますが、色々なバリエーションがあります。これはよく観察される事例です。「異なる複数のポリアデニル化部位」というのはそのままの意味で、複数のpolyA付加サイトがあることです。一つの遺伝子であっても転写開始点もいくつも存在するので、一つの遺伝子において一つの転写開始点と一つのpolyAサイトというように決まった形だけが存在するわけではありません。 >《質問3》 >3'RACE法で釣り上げたcDNAについ ゲノム解析を行ったとありますが、あなたがmRNAを調製したサンプルとゲノムを調製したサンプルは同じですか（ゲノムだけ公共DBとかいうことはないですか）？挿入配列にがあってもORFが保たれるとか、そういった確認は既におこなっていますよね。 それからNUPとか言われても、あなたがどこの製品を使っているのか開示が無いので何の配列なのかさっぱりわかりません（まぁ、ある程度わかりますが、自分だけわかっていてもだめですよってことです。）

5'RACEおよび3'RACEでのトラブル 削除/引用 No.2615-1 - 2010/05/22 (土) 02:29:59 - nyamo 私は、遺伝子を扱う研究室に所属する修士課程の学生です。 RACE法を用いて既知の遺伝子のアイソフォームの同定を試みているのですが、 知識・経験不足で自力で解決出来ない問題に出くわしました。 この分野に詳しい方、恐れ入りますが、力を貸して頂けませんか？ 質問は4つあります。1つでも良いので、教えてください。 どうか、宜しくお願い致します。 (非常に初歩的な質問かも知れませんがお許し下さい。) （以下、具体的なトラブルの内容） ●5'RACEにて 【既知の遺伝子のcDNA】 5'-(UTR)(開始コドン)(遺伝子配列)(終止コドン)(UTR)(ポリA)-3' 【5'RACE法で釣り上げたcDNA】 5'-(NUPの配列)(既知の遺伝子配列の途中からの配列)(既知の遺伝子に特異的なプライマーの配列)-3' 5'RACE法で釣り上げたcDNAについて、 可能性A…上流にあるエクソンが欠けたmRNAのバリエーションである。 可能性B…RACE用のcDNAを作る際にRTが途中で止まり、不完全なcDNAを釣ってきただけである。 《質問1》 可能性AとBを見分けるポイントを教えてください。 (他の可能性がある場合は、それも含めた見分け方を教えてください) ●3'RACEにて 【既知の遺伝子のcDNA】 5'-(UTR)(開始コドン)(遺伝子配列)(終止コドン)(UTR)(ポリA)-3' 【3'RACE法で釣り上げたcDNA】 5'-(既知の遺伝子に特異的なプライマーの配列)(既知の遺伝子の配列)(既知の遺伝子には無い配列約100bp)(既知の遺伝子の配列約70bp)(既知の遺伝子には無いTやAを多く含む配列約200bp)(ポリA)-3' ※ポリAが付いている位置は、既知の遺伝子のcDNAの全長の半分くらいのところです。 《質問2》 3'RACE法で釣り上げたcDNAは、mRNAのバリエーションと考えてよろしいでしょうか？ 《質問3》 3'RACE法で釣り上げたcDNAについて、既知の遺伝子には無い配列約100bpは、GTで始まりAGで終わらないため、イントロンではないと考えられます。 しかし、この配列あたりのみゲノム解析をしたところゲノムの配列中にもこの配列が見当たらないため、エクソンでもない気がします。これの正体を教えてください。 《質問4》 RACE法のトラブルシューティングを調べたところ、 「異なる複数のポリアデニル化部位の使用により、複数の3'RACE産物が出来る」と書いてありました。 “異なる複数のポリアデニル化部位の使用”という表現がよくわかりません。 初歩的な質問ですが、どうかご教授ください。 (自分なりに調べたのですが、理解するのが困難でした。)

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