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(無題) 削除/引用 No.260-8 - 2009/04/02 (木) 18:51:48 - 再　 > SDSはDNAもdenatureしてしまうのでSDSは含まないモノを使用します。 > 別にSDS-PAGEはタンパクにしか使用できないモノではなく、 > ssDNAをみたいのであればSDS入りで、dsDNAであればSDS入りでといった具合で > 使用はできます。 > 濃縮効果の原理については上に書いてあるのでlow pHでも負に帯電しているDNAなら濃縮は可能です。 > 記述が２箇所ほど間違っているようです。理論的にDNAなら濃縮可能であっても、実用的にそれほど変わらないなら、２ゲル方式を取ることは面倒なためあまりないでしょう。DNAは強く負に荷電しているため、これは実用的、定量的な議論になると思います。 すでに指摘があるように、あまりに理論にこだわるあまり、実用的な部分が無視されているような気もします。

(無題) 削除/引用 No.260-7 - 2009/04/02 (木) 15:54:25 - Pumpkin う〜ん、トピ主さんの意図と皆様の回答を見ながら考えていたんですけど、やはり系が妥当ではないのだと思います。 >いまいちバンドがシャープにならないことと >薄いバンドがスタックすれば見えるようになるかもしれないという理由 と書かれていますが、それがトピ主さんの解析とする対象で間違いないのですか？それは他の方法で（弱いリガンドとおっしゃているそれそののもが結合している）確認が取れているのですか？ 見えないものを見えるようにしようとするあまり、あれこれと考えてしまっているのではないでしょうか。他の検証方法を考えるというのはどうでしょうか。トピ主さんの真意がくめていなければ、またご指摘ください。

(無題) 削除/引用 No.260-6 - 2009/04/02 (木) 15:43:16 - まる >[Re:5] fさんは書きました : > SDS-PAGEの濃縮は、pH6.8下におけるKイオンとClイオンのディストリビューションにより生じるので、必ずしもSDS化せずともタンパク質が負にチャージしてる限り濃縮は起こるように思いますがいかがでしょうか。 > > ただし、電圧の大部分がKとClで構成される狭いエリア（濃縮ゲル内）にかかるため、タンパク質-DNAコンプレックスにかかる電気的な影響も半端無いと思います。低電圧でやってみるのも面白いかもしれませんね。 濃縮はKではなくグリシンによるものだったと思います。 バッファーにKは入ってませんしSDSとKは混ぜてはいけないですし。 グリシンの等電点が6.0でアルカリ性の泳動バッファー中では負に帯電しますが、ph6.8の濃縮ゲルではグリシンの大部分が双性イオンの状態となり、 電荷的に中性になるため、その領域は通電性が落ち、SDS化されたタンパクやClイオンは濃縮ゲル中でも負電荷を帯びているので通電します。 Clはすぐに流れていくためタンパクサンプルの直下にはイオンがほぼなく、 また直上は中性電荷のグリシンのため通電できず、コンダクタンスがサンプルの部分だけ高くなるためにほぼすべての電圧がサンプルにかかる。 しかし泳動されてイオンがない部分へ進むと急に電圧がかからなくなるためそこで電圧がかかるまで停止する。 ですので確かにかなりの電圧がかかることになります。 ただ、native-pageでタンパク質の複合体を泳動し、分離することもあるのでEMSAでも可能なのではないかと重い、質問した次第です。 >[Re:4] 再　さんは書きました : > DNAの動きを見るわけですから、SDSゲルを使うことを前提とした蛋白の動きを見る原理（とくに濃縮効果）は基本的に適用できないと思います。 SDSはDNAもdenatureしてしまうのでSDSは含まないモノを使用します。 別にSDS-PAGEはタンパクにしか使用できないモノではなく、 ssDNAをみたいのであればSDS入りで、dsDNAであればSDS入りでといった具合で 使用はできます。 濃縮効果の原理については上に書いてあるのでlow pHでも負に帯電しているDNAなら濃縮は可能です。

(無題) 削除/引用 No.260-5 - 2009/04/02 (木) 10:20:26 - f SDS-PAGEの濃縮は、pH6.8下におけるKイオンとClイオンのディストリビューションにより生じるので、必ずしもSDS化せずともタンパク質が負にチャージしてる限り濃縮は起こるように思いますがいかがでしょうか。 ただし、電圧の大部分がKとClで構成される狭いエリア（濃縮ゲル内）にかかるため、タンパク質-DNAコンプレックスにかかる電気的な影響も半端無いと思います。低電圧でやってみるのも面白いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.260-4 - 2009/04/01 (水) 21:59:07 - 再　 DNAの動きを見るわけですから、SDSゲルを使うことを前提とした蛋白の動きを見る原理（とくに濃縮効果）は基本的に適用できないと思います。

(無題) 削除/引用 No.260-3 - 2009/04/01 (水) 15:39:40 - まる >[Re:2] Pumpkinさんは書きました : > むしろ、2ゲル式という方法をとる必要が全くないように思われますが、このあたりの見解はいかがお考えですか？ いまいちバンドがシャープにならないことと 薄いバンドがスタックすれば見えるようになるかもしれないという理由で 調べています。 DNAだけであればTBEの場合とNative-Pageの場合の両方で泳動しましたが どちらでも問題はないようでした。 pH6.8でのDNAのチャージは負のままなので当たり前といえば当たり前ですが。 もともと弱いligandとしての作用を調べているため、 エンハンサーへの結合が弱い可能性が考えられるため、 なるべく見やすい条件でと考えております。 核内への滞在時間が一般的に知られているligandと比べて短いこと まではみているのですが、結合までは調べ切れていないためEMSAをとっています。 以前このフォーラムでその方法があるという書き込みをみて、 バンドがシャープになるという話があったのですがどこか失念してしまいました。

(無題) 削除/引用 No.260-2 - 2009/04/01 (水) 14:37:22 - Pumpkin むしろ、2ゲル式という方法をとる必要が全くないように思われますが、このあたりの見解はいかがお考えですか？

EMSAのゲルについて 削除/引用 No.260-1 - 2009/04/01 (水) 11:32:15 - まる いつも参考にさせていただいております。 EMSAの実験を始めたのですが、いろいろな論文やプロトコールをみても ゲルのバッファーはTBEあるいはTGEであって SDS-PAGEのようなTris-HClの組成のものは見かけません。 DNA-protein interactionを切らないためにSDSを使わないまでは 理解できますが、2ゲル式の方法をとらないのには何か理由があるのでしょうか？ low pHが結合をはずすようなことがあるのでしょうか？ low pHでDNAとタンパクの結合が強くなる、という報告は見つけたのですが、 電気泳動中に結合してしまうことが起きるのでしょうか？ またビオチン-アビジン系でブロッキングする場合ブロッキング剤中の 内在性ビオチンが問題になると思うのですが、内在性ビオチンは ナイロンメンブレンに吸着されるのでしょうか？ それともビオチン-アビジン吸着反応の時のみにブロッキング剤側に トラップされることのみが問題になるのでしょうか？ amersham blocking reagentの説明だとブロッキングには問題ないように 思われるのですが。 よろしくお願いいたします。

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