全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2587-19 - 2010/05/21 (金) 15:53:33 - ばいや >[Re:18] touma+Tさんは書きました : > 中年様 > >>damメチル > 確かにメチル化は考えられますが、設計上考えにくいですね。 設計上考えにくいとかの問題ではなく、メチル化される配列だったかどうかの問題です。 メチル化される配列だったかどうか、次にメチル化する菌を用いたかどうかです。

(無題) 削除/引用 No.2587-18 - 2010/05/21 (金) 14:26:26 - touma+T 中年様 >>damメチル 確かにメチル化は考えられますが、設計上考えにくいですね。

(無題) 削除/引用 No.2587-17 - 2010/05/21 (金) 14:25:26 - touma+T >>1.0×106cfu/μgで問題はなく 問題あると思いますけど。 自作であっても、この数値は酷いと思います。 トラブルが起きていないサブクローニングであればいいのですが、 トラブルが起きている以上は、もう少しまともなコンピを使われてはいかがでしょうか。 検討させて頂きます。 >ligation high >>HPを見てもよく分からなかったのですが、おそらくPEGが入っていますよね。 PEGを含まないligaseの方が長いDNAのライゲーションに向いているときいたことがあります。 もしラボにあれば、そちらも試してみてはいかがでしょうか。 ちょっと分からないのですが、先輩に聞いてみたいと思います。 >16℃ 2hincubate >>長いDNAの場合は4℃ O/Nの方がいい場合がありました。 なるほど。そちらについても検討させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.2587-16 - 2010/05/21 (金) 14:21:35 - touma+T ats様 >>500bpと548bpなら、2%ゲル（1%でも可能）で判断できます。 （念のためoriginalのplasmidと）組み換えたものをXbaI+NotI、XhoI+NotIで切断し、500bpなのか548bpなのか比べてみたらいかがでしょうか。 早速行いたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2587-15 - 2010/05/21 (金) 14:20:02 - touma+T in situ様 >>とありますが、ここの確認は何でやっていますか？ エチブロ染色ですか？ だとしたらこのときに流した量はどのくらいですか？ それはDNA量でしょうか？ DNA量については2000ngでcut後およそ10ngという計算です。 銀染色は確かに良いかもしれませんね。 ご参考にさせて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.2587-14 - 2010/05/21 (金) 14:17:36 - touma+T 中年様 確かにそうですね。 一番てっとり早いのはシークエンスしちゃえば良いのですが、ここで結果でないと教授に話すときに説得力がありませんので。

(無題) 削除/引用 No.2587-13 - 2010/05/21 (金) 14:14:33 - touma+T ats様 >>なお、ベクターの脱リン酸は必須ではありません。self-ligationを防ぐためです。 平滑末端というわけでもないので・・しかし、やるにこしたことはありませんね。DNAのロスは否めませんが。 >>もう少しoligoを加えるのも良いかもしれません（モル比10x~30x）。過去のスレッドを探してください。 そこまで入れてしまうと確かに入る確立は増えますが、逆にthrombinサイトが短い分逆向きになって何個も入ってしまう恐れがあるのではないでしょうか？ >>どうしても成功しない場合は、 500bp+Oligo(モル比10x~30xほど）で37C ligationして、buffer置換、Xba1とNot1で2重切断し、542bpの断片を確認・切り出しして、vectorと2 fragment ligationを行ってみましょう。 まれに（周りの塩基配列の影響なのか）連結されにくい部位がありますので、その影響を減らすために、まずinsertを作り出す方針です。 多めの目的insertを調製するために、目的insertを別のクローニングベクターにサブクローニングするのも良いでしょう。 仰るとおりですね。

(無題) 削除/引用 No.2587-12 - 2010/05/20 (木) 16:47:23 - Eire ~さんのご意見とかぶりますが、 私の経験では、3 piece (or 4 piece)-ligation の場合は、いわゆる quick ligation のシステム（ligation high もこの類のキットですよね）ではうまく行かず、昔ながらの T4 DNA ligase, 16°C, O/N incubation ではちゃんと目的のクローンを得られることが多いです。なので、私なら ligation のシステムを conventional な T4 DNA ligase のシステムに替えてみると思います。Ligase は反応バッファーが古かったり、凍結融解を繰り返したものだと、バッファー中の ATP が分解され酵素反応が十分に起きない時があります。複数インサートをライゲーションしたい時は、このあたりの条件が sensitive な印象があるので、バッファーは小分け保存することで凍結融解の回数を減らす、必要に応じて ATP を加える、ということをしています。

カタロニアの鳥はpeace、peaceと・・・ 削除/引用 No.2587-11 - 2010/05/19 (水) 22:18:38 - 小言幸兵衞 本題とは外れますが、three-piece ligationで形質転換体の数が減るというのは大いにありそうですが、コロニーの生えが悪くなるという理由はありませんよ。

(無題) 削除/引用 No.2587-10 - 2010/05/19 (水) 19:14:27 - ザンギ 8000bpの発現コンストラクトのXhoIサイトにnon-directionalに48bpの合成DNAを挿入するのはなぜだめなのでしょう。 インサートの有無と方向の確認はPCRでできますよね。

(無題) 削除/引用 No.2587-9 - 2010/05/19 (水) 19:12:01 - 中年 先ほどは忘れていましたが、XbaIサイトがdamメチレーションで切れなくなっているという可能性もありますね。

(無題) 削除/引用 No.2587-8 - 2010/05/19 (水) 19:10:00 - ~ >1.0×106cfu/μgで問題はなく 問題あると思いますけど。 自作であっても、この数値は酷いと思います。 トラブルが起きていないサブクローニングであればいいのですが、 トラブルが起きている以上は、もう少しまともなコンピを使われてはいかがでしょうか。 >ligation high HPを見てもよく分からなかったのですが、おそらくPEGが入っていますよね。 PEGを含まないligaseの方が長いDNAのライゲーションに向いているときいたことがあります。 もしラボにあれば、そちらも試してみてはいかがでしょうか。 >16℃ 2hincubate 長いDNAの場合は4℃ O/Nの方がいい場合がありました。 個人的には、ライゲーションの条件などをがんばるよりも、 10^8 cfu/ug DNA以上のコンピを使ってコロニーをたくさん得て、 スロンビンサイトをはさむプライマーを設計して、 コロニーPCRでとりあえずのスクリーニングをしてしまうのが早いような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2587-7 - 2010/05/19 (水) 18:50:00 - ats 中年さん、in situさんのご指摘通り、48bpの確認法が問題ですね。 500bpと548bpなら、2%ゲル（1%でも可能）で判断できます。 （念のためoriginalのplasmidと）組み換えたものをXbaI+NotI、XhoI+NotIで切断し、500bpなのか548bpなのか比べてみたらいかがでしょうか。 タンパク機能に問題無ければOligo設計の段階で48bpに他の制限酵素部位を組み込めば、確認が容易になりましたね。サブクローニングは完成品が確認しやすいように計画を立てるのも重要です。

(無題) 削除/引用 No.2587-6 - 2010/05/19 (水) 17:53:57 - in situ >独自にアニーリングを行い20%PAGEで確認したところ100bpラダーマーカーとコントロールで流した一本鎖オリゴの間の約48bp付近にバンドを確認したため とありますが、ここの確認は何でやっていますか？ エチブロ染色ですか？ だとしたらこのときに流した量はどのくらいですか？ >制限酵素を含んでいるため電気泳動中に引きずっている感じがありましたが問題ないということを聞いたのでそのままエチジウムブロマイドで染色を行い確認しました。 　 >結果、thrombinサイトを確認することができませんでした。一応、2度ほど同じ操作で試しましたが結果は同じでした。 中年さんがおっしゃっているように10ng程度の48bpでは、エチブロ染色で見えない可能性が高いです。 銀染色するか、もしくはアニーリングしたオリゴのうち一つをプライマーに用いてPCRによるチェックを行うかに変更した方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2587-5 - 2010/05/19 (水) 17:22:28 - 中年 PAGEで48bpのバンドが検出できなかっただけで、実は期待通りのプラスミドが取れているということはないですか。完全に消化できていたとして10ng程度のバンドですよね。泳動パターンが引きずっているとのことなので、ここでロスがあればEtBr染色で見えないこともあるんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2587-4 - 2010/05/19 (水) 14:27:15 - ats 手順的には問題ないようですね。 なお、ベクターの脱リン酸は必須ではありません。self-ligationを防ぐためです。 もう少しoligoを加えるのも良いかもしれません（モル比10x~30x）。過去のスレッドを探してください。 どうしても成功しない場合は、 500bp+Oligo(モル比10x~30xほど）で37C ligationして、buffer置換、Xba1とNot1で2重切断し、542bpの断片を確認・切り出しして、vectorと2 fragment ligationを行ってみましょう。 まれに（周りの塩基配列の影響なのか）連結されにくい部位がありますので、その影響を減らすために、まずinsertを作り出す方針です。 多めの目的insertを調製するために、目的insertを別のクローニングベクターにサブクローニングするのも良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2587-3 - 2010/05/19 (水) 13:21:20 - touma+T ご質問ありがとうございます。 1)1:3とかはモル比ですよね。重量比だと1000倍近いモル比になるので失敗します。 >>モル比で行いました。 (2)insert（オリゴ）はリン酸化したのでしょうか。ベクターは脱リン酸したのでしょうか。 >>オリゴはPを付加しているものを注文してあります。 　ベクターの脱リン酸はせずに行いました。あまり気にしたことがなかったのですが脱リン酸しなければinsertは結合しないものなのでしょうか？ (3)なぜわざわざ3 fragment ligationにしたのでしょうか。単純にXba1-Xho1部位に組み込むのではいけないのでしょうか。 >>templateで作製してあったものがXba1とXho1（スペーサー）が隣接しており単純に制限酵素が余分な配列がないと切断できないことがあるため（特にXho1サイト）3 peaceで行いました。 (4)「フレームのズレ少ない」とは？1bpでもフレームがずれていれば白くなりますよ。フレームはずれてなく挿入されるアミノ酸が少ないという意味ですよね。 説明下手ですみません。そのように解釈していただいて大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.2587-2 - 2010/05/19 (水) 10:38:26 - ats 確認の質問ですが、 (1)1:3とかはモル比ですよね。重量比だと1000倍近いモル比になるので失敗します。 (2)insert（オリゴ）はリン酸化したのでしょうか。ベクターは脱リン酸したのでしょうか。 (3)なぜわざわざ3 fragment ligationにしたのでしょうか。単純にXba1-Xho1部位に組み込むのではいけないのでしょうか。 (4)「フレームのズレ少ない」とは？1bpでもフレームがずれていれば白くなりますよ。フレームはずれてなく挿入されるアミノ酸が少ないという意味ですよね。

three peace ligation 削除/引用 No.2587-1 - 2010/05/19 (水) 10:14:58 - touma T Three peace ligation法によるvector作製 当研究室で樹立しているpCI-neo vector(Xhoサイトを削除したもの約5500bp)のマルチクローニングサイトにEcoR1からXba1サイトの間に約2000bpのあるタンパク質発現用の塩基配列を組み込み、さらにXho1からNot1サイトの間に約500bpのあるタンパク質発現用の塩基配列を組み込み総塩基配列約8000bpのvector（細胞にトランスフェクション後発現確認済み）を用いてfusion proteinを発現させた。 Template EcoR1-2000bp-Xba1-Xho1-500bp-Not1 その応用としてXba1とXho1の間にthrombin認識サイト(42bp)のアニーリングオリゴを組み込むこととなった。まず業者に１本鎖ずつXba1サイトとXho1サイトの断片付のオリゴを頼みその後、独自にアニーリングを行い20%PAGEで確認したところ100bpラダーマーカーとコントロールで流した一本鎖オリゴの間の約48bp付近にバンドを確認したため無事にアニーリングが成功したとみなした。 次に、本題のthree peace ligationの話ですが、まず先ほど述べたvectorをテンプレートとし、vector側Xba1とNot1で制限酵素処理を行いベクター側のfragmentを作製した。次に、Xho1とNot1で制限酵素処理を行いinsertに用いるfragmentを作製しました。こちらについては、2% agaroseによりそれぞれ目的のバンドの位置に確認が出来切り出しを行いQIAGENのextarction kitで精製を行いました。そして、先ほど述べたアニーリングオリゴによる３点でのligationとなります。 　それぞれベクター側(100ng分に固定)：insert：アニーリングオリゴを1:1:1の割合で、また1:2:4の割合で、さらにinsertを含まないself ligationそれぞれligation highを用いて16℃ 2hincubateし、コンピテントセル(TOP10)にtransformationしLB+amp(100μg/ml)プレートに37℃ 16h incubateしたのですが、コロニーが小さく生えがいまいちでしたが、self ligationよりかは少し多くのコロニーが見られました。コンピテントセルの形質転換効率が1.0×106cfu/μgで問題はなく、three peace ligatinだと生えが悪いとは聞いてはいましたので問題ないのかと思い6sampleずつ液体培養しminiprepでプラスミド抽出を行い1%agaroseで確認したところコントロールであるテンプレートと同じ付近にバンドが確認できたので（thrombinサイト48bpなので違いがよくわからない）2000ngのDNAを用いてXba1とXho1で制限酵素処理を行い20%PAGEでthrombinサイトの有無を確認しました。制限酵素を含んでいるため電気泳動中に引きずっている感じがありましたが問題ないということを聞いたのでそのままエチジウムブロマイドで染色を行い確認しました。 　 　結果、thrombinサイトを確認することができませんでした。一応、2度ほど同じ操作で試しましたが結果は同じでした。 アニーリングオリゴが駄目なのかと考えpbluescript SK(-)のXba1とXho1で制限酵素処理を行い上記のように精製し（Xba1-Xho1サイト確認済）アニーリングオリゴと1:3の割合でligationし、コントロールでこちらもself ligationした後にTOP10にtransformation後LB+amp+Xgalプレートにまいて確認しました。結果は、どちらもほとんどがblueでおそらくフレームのズレ少ないのとpBluescriptのblue whiteはあまりあてにならないということも聞いていたのであまり参考にはなりませんでしたが・・・。 　何が原因なのか正直分かりかねます。皆様のご意見を何卒宜しくお願致します。 　長々と失礼致しました。

全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---