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(No.5修正) 削除/引用 No.2586-9 - 2010/05/20 (木) 01:20:35 - Tb （コメントNo.5の修正です。本文は同じです） > 新規に導入した抗体がワークしているかに関して 新規というのが自分たちで作成したという意味ではなく、初めて試薬会社から購入したという意味で用いているならば、まあそんなものかもしれません。 FACSは今はともかくついこの前までは免疫分野でリンパ球を染めてるのがほとんどで、えてしてWesternもやったことのないひとがメーカーのデータを鵜呑みにしてぽんぽん測っていました。昔はCD3, CD4, CD8とか当時でさえもう枯れた抗体で染めてれば十分だったのでまあ深く考える必要がありませんでした。 しかし、昨今のマイナーな抗原、弱い発現分子、1%未満の微少集団、たちの悪いノンスペする変な細胞、などをターゲットするのが盛んになってはそのような体質のままでいいのかは疑問です。アイソタイプコントロールという概念もただの目安でしかありませんし・・・。抗体染色の正当性については、自分で抗体作りをしてみると、常に考えなくてはならないことに気づきます。余談になりますが、私がこのフォーラムに初めて書き込みをしたのは、とある有名メーカーのFACS抗体がニセ染色であり、その抗体を商品から抹消させるのに苦労したという話しでした。 明確なルールはないかもしれませんが、自分が納得できないときは、できるだけ検証しようとした方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2586-7 - 2010/05/19 (水) 23:54:56 - 某国スパイ それと、標識二次抗体で検出する際に、二次抗体の一次抗体へのアフィニティにクローン間で差があることを無視して、抗原の発現量だとかアフィニティだとか議論してるやつ。 もったいないなあと思う。

(無題) 削除/引用 No.2586-6 - 2010/05/19 (水) 22:51:22 - FACS始めました Tbさま > しかし、昨今のマイナーな抗原、弱い発現分子、1%未満の微少集団、たちの悪いノンスペする変な細胞、などをターゲットするのが盛んになってはそのような体質のままでいいのかは疑問です。アイソタイプコントロールという概念もただの目安でしかありませんし・・・。 なんとなくモヤモヤしていたことはまさにそのようなことです。 十分検証が行なわれてきた抗体で細胞集団を分ける、と言う目的ならまだしも、 Tbさまが仰るような難しい実験でFACSがfirst choiceであるということに疑問を持った訳です。 そもそものきっかけとして、同僚が膜タンパク (IL15R) の免疫染色を行なう際、 抗体がFACSで動いたということでポジコンもなしで行なっていて、 案の定細胞膜は染まらなかったのですが、 その理由を共焦点顕微鏡はFACSに比べてずっと感度が低いから、と考えていたことでした。

売ってるメーカーで 削除/引用 No.2586-4 - 2010/05/19 (水) 10:08:28 - ami その抗原を発現させたセルラインくらいまでは検討してるはずですが。KOやKDよりはエビデンスとして劣りますが、甘いというほどではないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2586-3 - 2010/05/19 (水) 09:50:25 - FACS始めました ＞ウさま 返信いただきありがとうございます。 確かに全ての分子でKO, 過剰発現を行なうのは面倒でというのはわかります。 ウエスタンでも、免疫染色でも、必ずやると言うことはありません。 ただ気持ち悪いと思うのは、ウエスタンでは標的分子の分子量が、 組織学では局在や発現部位という、extraな情報があるのに対して、 FACSではそれがないというか、ドットブロットでポジティブと言っているのと 同じなんじゃないかと思っている訳です。 モノクロを使っても複数のバンドが出てしまうことは結構な頻度でありますよね。 そう考えるとその抗体が目的のモノを認識した結果とはいえないんじゃないかと。 挑発的になっているのでは決してありませんので、 FACSを使っておられる方々のスタンダードというかお考えをお聞かせ願えればと思っております。

(無題) 削除/引用 No.2586-2 - 2010/05/19 (水) 09:18:26 - ウ >厳密にはネガコンはKOやKDで、ポジコンは過剰発現であるべきと思っておりました。 おっしゃる通りだとは思います。 ただ目的の抗体が非特異的な結合をしているかそうではないかは、コントロールと比較することで一応確信が得られると思います。なので、一次抗体にはあまりポリクロは使いませんよね。 ただ使用する抗体が目的の抗原だけに特異的に結合するという事実に信頼がおけることが前庭となりますが。 なかなか１つの分子をsiやら、KOを入手すると手間がかかりますよね。もちろん厳密にはそうしたいのはやまやまですが、なかなか腰が重くて上がりません。

FACS用抗体の特異性の確認 削除/引用 No.2586-1 - 2010/05/19 (水) 09:03:39 - FACS始めました いつも勉強させていただいております。 最近FACSがメインのラボに入りました。 が、FACS実験における抗体の使用に関してどうも腑に落ちない感覚があります。 うちのラボだけなのかもしれませんが、新規に導入した抗体がワークしているかに関して isoformコントロールで染めたサンプルに対してのみ判断しております。 一方私がこれまで行なってきた、免疫組織学染色やウエスタンでは 抗体がワークするかの基準がもうちょっと厳しくて、 厳密にはネガコンはKOやKDで、ポジコンは過剰発現であるべきと思っておりました。 Flowcytometerというブラックボックスの割にはそこら辺の判断基準が甘いように思うのですが これはうちのラボの問題なのでしょうか。それともFACSの業界ではそんなものなのでしょうか。 FACSの経験の豊富な方々のご意見を頂ければ幸いです。

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