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(無題) 削除/引用 No.2574-5 - 2010/05/20 (木) 14:03:30 - ゆう ご助言となるコメントを頂き大変助かりました。 ありがとうございます。 ＞うさん 細胞が傷んでいる可能性もあるとのことですし、次回行うときはもう少し丁寧に行うようにしてみます。 ＞ウさん 浮いている可能性もあるんですね。 浮いている細胞も回収し継代を行うようにしてみます。 ＞DCさん 様々なご指摘ありがとうございます。 ・いくつかの論文で確認したのですが、どれも接着した細胞を使っているようにお見受けしたので、DCとは考えれなかったです。 次回行った際に染めてみるようにします。 ・プレートは６Well Plateを使っています。 しかし、Petri dishだと浮き易くなることは知りませんでした、助かりました。 ・GM-CSFを使うとMQが誘導されるのは知っていたのですが、IL−４によって抑制されるのですね。 お一つお聞かせ願いたいのですが、ある論文では末梢血からCD14陽性細胞を回収し、GM-CSF、IL-4存在下にてDCの研究をされていると思います。単球からDCだけでなくMQも一緒に誘導してしまった場合、DCのみに回収して行わなくても良いのでしょうか？ ・サイトカイン濃度については私も濃いとは思っていました。 初めて行う実験でして、濃度が薄すぎて誘導されないのを恐れてしまい濃く使ってみました。

(無題) 削除/引用 No.2574-4 - 2010/05/18 (火) 13:48:28 - DC MoDC誘導プロトコルは複数存在するので、ゆうさんがどのプロトコルを採用しているかわかりませんが、私の印象では ・まず、浮いた細胞はDCじゃないのですか？ 　FACS等でDCマーカー染めてみました？ ・まさかPetri dish使ってませんよね？ 　Petri使う方法はマウスではありますがヒトではどうなんでしょう？無理ではないと思いますが、Petri使うとDCはより浮きやすくなります。 ・GM-CSF使えばMφが分化して、その周りにDCが遅れて分化してきます。 　接着細胞が少ないのはIL-4でMφ分化が少し抑制されて、まだDCへの分化がいっていないMonocyteが浮いているように見えるのでは？ ・関係ないかもしれませんが、サイトカイン濃度がちょっと濃いのでは？ 　10 ng/mLが大抵スタンダードだと思うのですがみなさんいかがでしょう？

(無題) 削除/引用 No.2574-3 - 2010/05/18 (火) 10:48:34 - ウ DCはMΦに比べたら接着は弱いです。というか活性化させていないと浮遊状態でいる場合も少なくないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2574-2 - 2010/05/18 (火) 07:49:53 - う MACSのやり方が下手で、細胞が弱っているんじゃないですか。

Monocyte由来DCの誘導について 削除/引用 No.2574-1 - 2010/05/17 (月) 22:41:33 - ゆう 初歩的な問題で申し訳ないのですが、みなさんにご意見賜りたくトピックをたてさせて頂きました。 現在、ヒト末梢血から採取したPBMCからMACSから購入のCD14Microbeadsを用い、Monocyte由来のDCの誘導を試みています。 いくつかの論文を読んで行っているのですが、先ずフラスコ面に細胞が接着せず、継代開始３日後でも浮いている細胞がほとんどの状況です。 培養液はGIBCOのRPMI1640を使用 誘導サイトカインとしてIL-4、GM-CSF/Peprotechのを50ug/mLで行っています。 いくつか問題点があると思うのですが、ご教授願えましたら助かります。 また、ご存知の方がおられしたら教えて頂きたいのですが、6well plateにてDCをコンフルの状況にしたい場合は末梢血液はどのくらい必要になりますでしょうか？

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