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(無題) 削除/引用 No.2563-2 - 2010/05/17 (月) 09:47:48 - ~ 好みや流派によると思いますが、 プライマーは発注して数日くらい、 ゲノムDNA抽出は1〜2日くらいに対して BACの輸入は1週間以上はかかると思います。 そのため、プライマー発注とゲノムDNA抽出を平行して行って、 多少PCRの条件検討をしてからBACを買うか決めてもいいと思います。 （お金に余裕があれば、BACの発注も一緒にして、最短時間で進めましょう） プライマーはGC richな場合が多いようで、PCRで増えにくい／増やせなかったことがあります。 そのため、BACを購入できるのであれば、あまりゲノミックPCRにいれこまないほうがいいと思います。 個人的には、LA-taq with GC bufferがお勧めです。 何kb増やしたいのかによりますが、1〜2kbであれば、 Ex taqでもそれほどfidelityの問題は生じないと思います。 変異が入ったとしても、ミスが入っていない部分を切り貼りすればいいでしょう。 また、おそらくは配列を読みますよね。 そのため、目的のフラグメント全体を増やすプライマーだけでなく、 数百bpを読んだり増やしたり出来る位の頻度で、中にも増幅用かつシーケンシング用として使えるプライマーを作っておきましょう。 長い配列が増やせなくても、短い配列を増幅して切り貼りすれば、 目的の配列を得ることが出来ます。

レポーターアッセイ用のプロモーター領域の増幅 削除/引用 No.2563-1 - 2010/05/17 (月) 00:44:09 - ＴＳ いつも勉強させて頂いています。 今回、はじめてレポーターアッセイを立ち上げたいと思っているのですが、 プロモーター領域の増幅に関してご質問させてください。 プロモーター領域を増幅、クローニングするために、 培養細胞のDNAをテンプレートにしようと考えていたのですが、 論文を調べていると、BACを使用している人もいるようです。 たしかに、膨大なDNAから目的プロモーター領域だけど、簡単に増幅してこれるのかな、という疑問もあるのですが、ファーストチョイスとしてはどちらを選ぶべきなのでしょうか？ また、High fidelity polymeraseとして、これまではPfuシリーズを使っていたのですが、プロモーター領域の増幅の際には、Ex Taqとかのほうが増幅がかかりやすいという情報を聞きました。 おすすめのPolymeraseなどありましたら、教えてください。 経験のない実験系の立ち上げで、勘違いなどもあるかもしれませんが、よろしくお願いします。

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