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Southern blot：wtとtargetingのバンドの濃さが違ってしまう 削除/引用 No.256-5 - 2009/04/01 (水) 22:57:57 - みっちゃん 返答ありがとうございます。 ランダムインテグレーションのES細胞が混ざってしまっている ということでしょうか。（pick upの時に混ざったのかも） 今回はG418耐性コロニーの数があまり多くなく、 ひとつひとつのコロニーは結構離れていたため 大丈夫だと思っていましたが、可能性としては一番高そうです。 急がば回れで、再度蒔き直してやってみます。

(無題) 削除/引用 No.256-4 - 2009/03/31 (火) 23:02:49 - あまり詳しくないですが ランダムインテグレーションです。 理論的には相同組換えのみでG418耐性になりますが、実際にはターゲッティングする部位以外にランダム挿入が起こり、G418耐性になります。そのようなクローンが出現するとサザンでは見かけ上、wild typeと同じになります。 　コンストラクトを導入しなかったものに関してはランダムインテグレーションさえも起こらないので、コロニーは当然ゼロになります。 ですので、G418 selectionをやり直しても効果はないでしょう。それよりはばらばらにして、もう一度撒き直してコロニー形成、pick upをやり直した方が有効でしょう。ただ、この方法はpassageがかさむので分化する恐れがあります。

Southern blot：wtとtargetingのバンドの濃さが違ってしまう 削除/引用 No.256-3 - 2009/03/31 (火) 22:55:49 - みっちゃん ありがとうございます。 その可能性も考えて、これからもう一度G418selectionを してからゲノムを回収してみようと考えているところです。 ただ、最初のpick upまでのところで、G418でしっかり selectionしていて、wtはいないはずなので、 （ネガコンのwt+G418では全部細胞が死滅していました） その場合、どうしてwtが出てきたのか（どこから来たのか）の 説明が付かずに、頭を悩ませています。 一旦、相同組換えで遺伝子座にIRES-neoカセットが挿入された後、 それがなくなってしまうことはあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.256-2 - 2009/03/31 (火) 22:41:14 - あまり経験はないですが ESクローンがWTのものとmutantが混合している可能性があると思います。 mutantの割合が少ない場合はmutantバンドのみ薄くなります。

Southern blot：wtとtargetingのバンドの濃さが違ってしまう 削除/引用 No.256-1 - 2009/03/31 (火) 20:29:18 - みっちゃん ES細胞である遺伝子座についてターゲッティングしました。 薬剤(G418)耐性で得られたコロニーのうち、 PCRで相同組換えが確認出来たクローンのいくつかについて さらにSouthern blotで確認したところ、 wtのバンドと相同組換えが起きているバンドの濃さが 明らかに違う（相同組換えのバンドがwtの1/2~1/3の濃さ）ものが 出てきました。もちろん両方が同じ濃さのバンドのクローンもあります。 これは5'側、3'側のprobeでも、同じ現象が見られました。 またneo probeで確認したところ、相同組換えが起こったときに 見られるバンドのみが検出され、他の位置にバンドはありませんでした。 　　A) wt:12kb（5'側、3'側のprobeとも同じ位置） 　　B) 相同組換え 5'側probe：5kb 　　C) 相同組換え 3'側probe・neo probe：9kb としたときに、 　　　　A)のバンドの濃さを10とすると、 　　　　B)やC)のバンドは、3~5くらいの濃さになります。 コロニーpick upまではG418を加え続けていましたが、 pick up後はG418を加えずに増やしました。 上記のような現象が起こってしまう理由としてはどんなことが 考えられるでしょうか。ご教示いただければ幸いです。 またこのような現象が起こった経験がある方がいらっしゃいますか？

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