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(無題) 削除/引用 No.255-15 - 2009/04/03 (金) 14:07:59 - on そのへんで使われている抗体って他の論文でも使われていたりして、結構限られていませんかね。 他の論文でうまくいっているのとかないのでしょうか？ 下の方もおっしゃっていますが、抗体をつくるときの抗原の場所とか、認識配列とか取説に書いてありません？ 上記の２つを考慮すれば、少なくとも抗体のチョイスはできるのでは？ それでもうまくいかないときは、実験操作がうまくいっていないということかも。

(無題) 削除/引用 No.255-14 - 2009/04/03 (金) 13:36:45 - Pumpkin >そもそもその抗体ではスーパーシフトしない 抗体と反応させると、ゲルシフトのバンドは消えるとおっしゃっているので、 抗体がワークしないのであれば、ゲルシフトしているバンドは消えないはずなので、プローブに結合している蛋白と抗体が反応しているのは間違いないのでしょう。 >その抗体はファミリーすべてを認識しないとか これも上記と同じように、ゲルシフトバンドは残るはずですね。 ですから、抗体と蛋白の相互作用によってDNA結合能を失ったという解釈は、解釈の1つとしては成り立ちそうですけど。ふつうはコールドなオリゴをコンペティターとしていれて競合阻害をみてDNA結合能をみますが、蛋白側のコンペティターをして抗体をいれたとすれば考えとしてはいいのかもしれません。というか、蛋白の配列が分かっているんだから、どの辺に抗体がアクセスしそうなのかわかりませんか。

(無題) 削除/引用 No.255-13 - 2009/04/03 (金) 12:47:51 - 通 誰も言わないけど、、、 そのDNA配列には他のタンパク質がくっついているので、そもそもその抗体ではスーパーシフトしな い、という可能性は？ 例えば、その転写因子にはファミリーに属するものが沢山あって、その抗体はファミリーすべてを認識しないとか、これは善意で解釈したものだけど。全く見当違いの抗体を使っている可能性は？

(無題) 削除/引用 No.255-12 - 2009/04/02 (木) 18:38:51 - 再　 > 今回の件では、DNA単独はどのレーンも見えています。 > きれいなバンド状ではなく、ゲルの下のほうが全体的にぼや〜と真っ黒な感じなので、そこから判断するのは難しいように思います。 > ゲルのトップにはそれらしいものは検出されていません。 > ラベルに使ったATPを除去していないということでしたら、除去すべきでしょう。 また、プローブの比活性をあげ、蛋白濃度をあげることにより、DNA単独の位置のバンドをある程度除去できれば、質問にある自分の仮説（抗体の結合部位がDNAとタンパクの結合部位、あるいはその付近にある抗体が結合することによりタンパクの状態が変化し、DNAと結合できなくなるなどです）が証明できるでしょう。

申し訳ありませんでした 削除/引用 No.255-11 - 2009/04/02 (木) 12:01:40 - なっさん punpkinさま、何度もありがとうございます。 私の中では、「競合阻害試験などで配列特異的な結合であることは示されているが、抗体を加えてもスーパーシフトしたバンドが見えない（DNA＋タンパクのバンドは消失）」というのはよくあることだったので、一般論としてどのような理由が考えられるかご意見を伺えたらと思い、質問させていただきました（ちなみに、実験当事者のためというより、自分が気になったためです）。 そのため、実験の詳細などはお示ししませんでした。 答えてくださる方に対して失礼になるとは全く気づいていなかったので、配慮が足りず、本当に申し訳なかったと思います。 再さま、ありがとうございます。 今回の件では、DNA単独はどのレーンも見えています。 きれいなバンド状ではなく、ゲルの下のほうが全体的にぼや〜と真っ黒な感じなので、そこから判断するのは難しいように思います。 ゲルのトップにはそれらしいものは検出されていません。

(無題) 削除/引用 No.255-10 - 2009/04/01 (水) 21:40:03 - 再　 >抗体の結合部位がDNAとタンパクの結合部位、あるいはその付近にある 抗体が結合することによりタンパクの状態が変化し、DNAと結合できなくなる などです。 これなら、DNA単独の位置に、DNAが再出現するはずですが、どうなのでしょうか？ ゲルのトップはどうなっていますか？ゲルに入り込まないほどの複合体を作っている場合がありますが、普通は、それは検出できます。

(無題) 削除/引用 No.255-9 - 2009/04/01 (水) 14:49:31 - Pumpkin 実験者が自分のプロトコルを開示しながら皆さんに意見を求めるのならば分かりますが... 実験の詳細が分からない以上、それに対する回答も適当なものになりますし、そもそも真剣に答えてくれている人に失礼ではないかと思います。あなたも、ここまでその人のために動かず、ご自分の研究を進めた方がよいと思いますよ(私も人のこと言えませんが）。 ご参考になれば Nuclear factor Y is required for basal activation and chromatin accessibility of fibroblast growth factor receptor 2 promoter in osteoblast-like cells. Sun F, Xie Q, Ma J, Yang S, Chen Q, Hong A. J Biol Chem. 2009 Jan 30;284(5):3136-47. Epub 2008 Dec 1.

(無題) 削除/引用 No.255-8 - 2009/04/01 (水) 14:29:52 - なっさん pumpkinさま、ものぽりさま、どうもありがとうございます。 自分の実験ならば再検討なり追加実験なりするのですが、 実は今回質問させていただいた内容は自分の実験についてではありません。（私がEMSA経験者であったため、意見を求められただけです。） そのため詳細が不明なのですが、スーパーシフトしたバンドが見えないことに関して色々突っ込まれて困っているようです。 ご本人は今あるデータだけでなんとかしたいようです。 スーパーシフトが見えないことに関して何か論じている文献などはご存知ありませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.255-7 - 2009/04/01 (水) 12:13:20 - ものぽり ポリクロ抗体の場合、抗原との結合数が違えばシフトバンドは複数生じ、スメアになり単一バンドとしては検出されず、一見消えたように見えるのではないでしょうか。エクスポーズ長くしてスメアのバックグランドを比較したらどうですか。

(無題) 削除/引用 No.255-6 - 2009/03/31 (火) 18:48:39 - Pumpkin どのくらいのゲル%で、どのくらいのゲル長かとか分からないのであれですが、もう少し見えるようにする努力があってもいいかと思いますが。その辺は、やりつくされた結果Supershift bandが見られないということでしょうか。 私の場合は、supershift bandが見られなかったという同様の体験がないからあれですが、トピ主さんは蛋白と抗体反応を先にやられているんですよね。私は核エキストラクトとDNAを先に混合してから、抗体反応していますが、この辺は関係ないでしょうか。抗体と蛋白が先にくっついてしまうことによるDNA結合能の欠如であれば、これによって元のバンド位置には検出されるかなと。思いつきです。 >スーパーシフトしたバンドが見えないことに対して突っ込まれた場合 どちらかというとChIPしなよ、っていう指摘がありそうですが、抗体を考慮出来なければChIPで落ちてきそうにないですね。

(無題) 削除/引用 No.255-5 - 2009/03/31 (火) 18:31:40 - なっさん 今回は他の抗体は試せません。 複合体が大きすぎて･･･という可能性もありますね。 私の知る限りでは、 抗体を添加してスーパーシフトしたバンドが見えなくても、 DNA＋タンパクのバンドが消失していればそれでOKという感じの論文がほとんどのように思います。 スーパーシフトしたバンドが見えないことに対して突っ込まれた場合にはどのように説明したらよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.255-4 - 2009/03/31 (火) 17:16:27 - Pumpkin >抗体の結合部位がDNAとタンパクの結合部位、あるいはその付近にある >抗体が結合することによりタンパクの状態が変化し、DNAと結合できなくなる どちらとも言えませんが、抗体がDNA-蛋白質コンプレックスにアクセスできないだけなら、元のバンドは消失しないでしょうから、目的蛋白質と抗体の反応によるのでしょうね。これは、反復実験で再現性があるのですよね。 他の抗体は試せないんですか？ゲルが硬すぎて、抗体が付くとでかくなりすぎてゲルに入らないなんてことは...ありえませんね。

(無題) 削除/引用 No.255-3 - 2009/03/31 (火) 16:55:25 - なっさん 急いで焦っていたため、説明不足で申し訳ありません。 元の位置のバンド（DNA＋タンパクのバンド）は消失しています。 タンパクに対する抗体を添加したときに、スーパーシフトしたバンドが見えない理由として考えられることが知りたいです。 現在の私の考えとしては、 抗体の結合部位がDNAとタンパクの結合部位、あるいはその付近にある 抗体が結合することによりタンパクの状態が変化し、DNAと結合できなくなる などです。 いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.255-2 - 2009/03/31 (火) 16:48:20 - Pumpkin 丁寧に確認ですが、EMSAでバンドが見られて、プローブと同配列のコールドなオリゴを過剰に加えることによって、バンドが見られなくなる。 で、その配列に結合する蛋白質が分かっていて、その抗体と反応させたが、スーパーシフトするどころか、元の位置にすらバンドが消失してしまったということですか？ それとも、元の位置にバンドは認められるがスーパーシフトしたバンドが認められないということですか？

至急：EMSAで、シフトしたバンドが見えない理由 削除/引用 No.255-1 - 2009/03/31 (火) 16:02:18 - なっさん プローブと同配列で非標識のコンペティターを用いた競合阻害試験により DNAとタンパクの結合が配列特異的であると思われるが、 スーパーシフトしたバンドが観察されない場合、 どのような原因が考えられますか？

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