BioTechnicalフォーラム [GFP融合タンパクの作製など]

GFP融合タンパクの作製など

No.2548-TOPIC - 2010/05/14 (金) 12:58:07 - caltee

　今、目的タンパクのｃ端にGFPをつけてその局在を観察しようとしています。(ベクターは invitroren社のpREST-EmGFPを使用しています）しかし、コロニーを観察した結果、緑に光るのに目的遺伝子が入っていなくて、GFPの空ベクターでした。　コロニーPCRによって、目的遺伝子が入っているコロニーは緑ではありませんでした。
　そこで、お聞きしたいですが。使用しているベクターは合ってますか。説明書を読んだところ、pREST-EmGFPにインサートを入れてもいいのようなことは書かれてません。
　初めて、GFP融合タンパク質を作りますが、使いやすいベクターがあれば、教えて下さい。　
　

　
　

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No.2548-11 - 2010/05/17 (月) 16:53:51 - Boston

融合するタンパク質が大腸菌にとって toxic な場合、空ベクターの大腸菌だけが選択的に生えてくると思います。細胞周期制御に関わるある遺伝子の PCR product をクローニングするのにすごく苦労した記憶があります。

(無題)

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No.2548-10 - 2010/05/17 (月) 08:52:18 - ばいや

・Western検出用抗体で検出してみる
・リンカー部分を長くしてGFPの立体構造をとりやすくする

(無題)

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No.2548-9 - 2010/05/14 (金) 23:44:27 - ザンギ

ネガコンの大腸菌と一緒にストリークしてUV当ててみればいいんじゃない？

それで光ればウェスタンでバンドの位置を確認して融合タンパクになってるか
みれば。

それが見えれば、codon usage とかSD配列とか改変すれば。

(無題)

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No.2548-8 - 2010/05/14 (金) 22:47:05 - ああああ

簡単に発現を確認したいのであれば、トランスイルミネーターにプレートを入れて目視でいいと思います。
ただ、UVなので大腸菌は死んでしまうと思いますが…

sequencing

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No.2548-7 - 2010/05/14 (金) 19:59:08 - baq

sequencing してみるのが最も確実です。
とりあえず開始コドン周辺と、
GFP との融合部位を確認すれば、
より多くの情報を得られるでしょう。

可能性として考えられるのは、次の 3 つです。
1. 目的遺伝子を発現していない。
(別の配列を誤ってクローニングしている、開始コドン周辺の
コンセンサス配列が間違っている、など)
2. 目的遺伝子は発現しているが、GFP 部分が翻訳されていない。
(読み枠が合っていない、予期しない停止コドンがある、など)
3. 目的遺伝子は GFP 融合蛋白質として発現しているが、
発現量が低く肉眼で蛍光を確認できない。

1, 2 については sequencing ではっきりします。
3 については、GFP の蛍光を観察できる環境を用意して
観察するか、ELISA、Western blot 等でタンパクを
検出するといった方法が考えられます。

(無題)

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No.2548-6 - 2010/05/14 (金) 19:36:16 - ばいや

励起波長はマニュアルに書いてあると思いますが。
UVでも大丈夫と思いますが。

(無題)

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No.2548-5 - 2010/05/14 (金) 16:09:57 - caltee

お答え、ありがとうございます。

　　stop codonを抜きました。
　
　　細胞内の局在を観察したいですが、まだ、uvを当てていません。GFPのみのコロニーだと、緑に見えますが、融合した後に、コロニーが緑じゃなくなりますが、UVに当たると蛍光します？
　　

(無題)

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No.2548-4 - 2010/05/14 (金) 15:21:05 - ああああ

追加です。
GFPの発現はUVを当てて観察してますか？
そうでないのなら、ただ単に目的遺伝子を融合させたために発現量が落ちただけではないでしょうか。