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(無題) 削除/引用 No.2543-4 - 2010/05/14 (金) 19:07:56 - トウジ どうもありがとうございました。 とりあえずアニーリングの温度を変えて検討いたします。

(無題) 削除/引用 No.2543-3 - 2010/05/14 (金) 09:53:01 - Pumpkin >SYBRgreenを用いてまったく同じ温度条件、ｻﾝﾌﾟﾙ量、ﾌﾟﾗｲﾏｰ最終濃度 PCRによるcDNA増幅と異なるところはQPCR用のSYBR mixを使っているという点ですね。温度条件やサンプル量、primer量が同じでもbufferやtaqが違うことによる差は非常に大きいです。ですから、シングルバンドを与えるかの予備実験もQPCRの系でやればよいと思います。 解決法は、えさんのおっしゃる方法で考えればいいと思います。まずはアニーリング温度を検討してみて、ダメならprimer新調ですかね。ちなみにわたしは3 setくらいprimerを注文しておき、シングルバンドを与えるsetを選んでいます。1set 1set試していたら時間の無駄ですし、SYRB系では割とうまくいかないことも多いですので。しかし、ここはラボでの状況次第ですのでご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.2543-2 - 2010/05/13 (木) 23:02:23 - え そのプライマーが半定量PCRでは使えて、定量PCRには使えないということでは。 よくあることです。プライマーを一新してもよし、アニールの温度を高めるなど検討もよし。

RCRとリアルタイムPCRの結果について 削除/引用 No.2543-1 - 2010/05/13 (木) 22:49:40 - トウジ 質問させていただきます。 通常のPCRでcDNAを増幅したところ、目的のバンド１本だけが確認でき、非特異的なバンドはありませんでした。 そこで、SYBRgreenを用いてまったく同じ温度条件、ｻﾝﾌﾟﾙ量、ﾌﾟﾗｲﾏｰ最終濃度でリアルタイムPCRを行ったところ、解離曲線で２つのピークが検出されてしまい、リアルタイムPCR後のproductを泳動したところ、目的のバンドより高い位置に非特異的な？バンドがいくつも検出されました。 原因として何が考えられるでしょうか？足りない情報等があればご指摘ください。よろしくお願いいたします。

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