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(無題) 削除/引用 No.2540-12 - 2010/05/17 (月) 10:56:06 - ATG 皆さま、丁寧なご回答をありがとうございます。 次にシーケンスを行う時はエタ沈をしてみることにしますが、それでも改善されない場合はプライマーに原因があるという感じですね。 アドバイスを下さったみなさま、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2540-11 - 2010/05/16 (日) 16:27:44 - TGA seqにはアルカリlysisしてエタ沈しただけのものでもRNAさえ消化されていればほとんどの場合は十分に読めるので、樹脂を使っているのでしたら、純度のせいではないと思います。業者が言う、「波形が重なっている」というのがどれくらいのことなのかにもよりますが。もっとも思い悩むくらいならエタ沈した方が早そうではあります。いわゆる「バックが高い」という事ならば、他の方がいっておられることに加えて、primerを20merを少し超えるくらいにして、aneal温度を少しあげてやれば解消される場合が多いです。

(無題) 削除/引用 No.2540-10 - 2010/05/14 (金) 21:11:39 - ザンギ プライマー配列は重複することがありますね。 ユニバーサルなプライマーの配列って何種類もあるんですが、意外と微妙です。 プライマー以外だと。 大腸菌由来のRNAの持ち込みが多いと、ノイズが多かった気がします。 液体培養の時間が短いとRNAも多いですね。 PEGチンがお勧めですが、エタチンでも緩い条件ならRNAをある程度は減らせたと思います。 RNAの混入だとランダムなノイズになるので4種類の塩基の全部で波形がでたような。

T-stretch? 削除/引用 No.2540-9 - 2010/05/14 (金) 16:08:46 - ats Tが10個位（だったかな？）連続していると、taq polが滑って1~数bpの長さの異なる産物ができるため、その配列以降シークエンス波形が重なることがあります。 TdTを用いてoligo A(T)を付加したRACE産物をクローニングした場合などは注意してください。 この場合primerを新たな場所に設計する必要があります。

(無題) 削除/引用 No.2540-8 - 2010/05/14 (金) 11:18:20 - Pumpkin >また、シングルコロニーについてはきちんと取れています。 これはどうやって確認しているのですか？例えば、非常に近接したコロニーのうちの一つをピックアップして、かつそれらが保持するプラスミドのインサートが僅かな差異だった場合、電気泳動的に区別できず、シークエンスで波形がかぶることから判明することもあり得ます（頻繁に波形のかぶりが起こるということから可能性は極めて低いと思いますが）。 やっておられるとかと思いますが、プラスミドの電気泳動と判断可能な制限酵素消化断片でisolateを確認した方がいいと思います（もちろん先述のような場合は判別付きませんが）。 やっぱり、BLASTでPrimerの特異性を確認した方がいいと思いますが、 >波形が重なっていると毎回外注先から言われます。 というのが気になるのです。

(無題) 削除/引用 No.2540-7 - 2010/05/14 (金) 11:06:49 - ATG >>ザンギさん プライマーはシーケンスのメーカーさんが用意しているのを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.2540-6 - 2010/05/14 (金) 00:05:22 - ザンギ これだけの情報ではなんとも言えませんが、プライマーの品質と純度は大丈夫なんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2540-5 - 2010/05/13 (木) 18:45:26 - ATG >>Pumpkin さん プライマーは毎回ベクター側で確認しています。 また、シングルコロニーについてはきちんと取れています。 >>ぶんさん プライマーに似た配列について確認しておりませんでした。 初歩的なところですが、確認を怠っており、これから確認したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2540-4 - 2010/05/13 (木) 16:41:01 - ぶん どう重なっているのかわからないのですが、 プライマーの配列（に似た配列）が他の部分にもありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2540-3 - 2010/05/13 (木) 15:01:55 - Pumpkin 波形が重なる理由は貧乏人様のおっしゃる2点だと思います。 しかし文面から読み取るに「毎回」という点とシークエンスプライマーがベクター側にあるのであれば、プライマーが十分特異性があるかを確認した方がよいですね。 シングルコロニーが毎回取れないのであれば、つついたコロニーを描線培養してシングルアイソレートしたほうがいいかもしれません。 実際に見ていないので確約できませんが、正しくキットを利用して電気泳動の結果と吸光度の値がよければ、シークエンスできないような純度だとは思えません。

(無題) 削除/引用 No.2540-2 - 2010/05/13 (木) 13:40:36 - 貧乏人 「波形が重なっている」とは、複数の配列が重なったような波形が十分な強度で得られているということでしょうか。もしその通りであれば、プラスミドがシングルクローンになっていないで混合物であるか、プライマーがプラスミド内の複数箇所にアニーリングしているかどちらかでしょう。

シーケンスの結果について 削除/引用 No.2540-1 - 2010/05/13 (木) 13:09:34 - ATG シーケンスのサンプルについて質問です。 私はインサートとプラスミドがきちんとligationしているかを確認するためにシーケンスを行っております。シーケンスは外注なのですが、波形が重なっていると毎回外注先から言われます。 一応ピークは確認できますが、波形が重なる原因としては、結局サンプルの純度が悪いということなのでしょうか？ サンプルは大腸菌をO/Nで培養後、BioRadのキットでプラスミド抽出を行っい、それをシーケンスに出しています。 プラスミド抽出後、エタ沈をした方がよいのでしょうか？A260/A280はだいたい2.1ぐらいです。 改善点やアドバイス等がありましたら、よろしくお願いします。

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