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PCRプロダクトの吸光度 トピック削除
No.2539-TOPIC - 2010/05/13 (木) 11:05:57 - taamtaam
あるGenomic DNAにSemi nested PCRを行って、PCR プロダクト（およそ400bp）を制限酵素でDigestionしたのですが、2%ゲルに流してもバンドは認められませんでした（マーカーは見えました）。念のため吸光度を測定したところ260/280は1.7ぐらいであり、濃度も測定できました（500ng/ul)。大変基本的なことを見落としていると思われ、恥ずかしながらこちらに質問させていただきました。どのような現象が生じているか御教示下さい。
　
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(無題) 削除/引用
No.2539-4 - 2010/05/13 (木) 16:38:41 - ぶん
PCR終了後はバンドがあったのでしょうか？
PCR後に泳動せず直ぐに制限酵素カットしたのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.2539-3 - 2010/05/13 (木) 11:42:08 - とおりすがり
核酸の紫外部の吸収は塩基の二重結合に由来するものなので、DNA, RNAだけでなくプライマー、ヌクレオチドなども強い吸収を持ちます。
だからPCRの産物がなくてもUVの吸収があるのは当たり前ですね。

(無題) 削除/引用
No.2539-2 - 2010/05/13 (木) 11:38:40 - ~
未反応のdNTPも吸光度を持ちますので、
エタ沈やカラム精製などでdNTPを除かないのであれば、
吸光度で濃度の評価をするのは止めた方がいいと思います。

制限酵素処理前に泳動して、きちんと増えているかを確認してから
digestionされてはいかがでしょうか。

PCRプロダクトの吸光度 削除/引用
No.2539-1 - 2010/05/13 (木) 11:05:57 - taamtaam
あるGenomic DNAにSemi nested PCRを行って、PCR プロダクト（およそ400bp）を制限酵素でDigestionしたのですが、2%ゲルに流してもバンドは認められませんでした（マーカーは見えました）。念のため吸光度を測定したところ260/280は1.7ぐらいであり、濃度も測定できました（500ng/ul)。大変基本的なことを見落としていると思われ、恥ずかしながらこちらに質問させていただきました。どのような現象が生じているか御教示下さい。
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