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この方法だと 削除/引用 No.2527-10 - 2010/06/19 (土) 00:04:30 - GB250 解剖から全工程終了まで15-20分で終わります。 基本的にトリプシンは最長で5分、普通のpassのときはいつも3分です。 長いトリプシン処理は細胞を溶かします。 確か15分くらいで全部溶けるはずです。 あとは必ず10％FCS-DMEMで中和した後でピペッティングすることですね。

(無題) 削除/引用 No.2527-9 - 2010/06/15 (火) 13:34:49 - ysb GB250さん ありがとうございます。 トリプシンは使わないほうが良かったんですね！ ぜひ試してみたいと思います。

いい方法 削除/引用 No.2527-8 - 2010/06/13 (日) 23:38:14 - GB250 NCIで使っていた作製法を紹介します。 手足、頭、内臓を除去したE13.5胎児を２匹/１5cm dishで投入 1mlシリンジに22Gをつないで胎児に２２Gの先端をくっつけてから、吸引排出を繰り返して（大きな塊を崩す程度）機械的に裁断する。多少の塊は一切気にしない。この時点でトリプシンは一切使わない。機械的な分離のみ。 ２−３日後にある程度密になってきたら、トリプシンEDTAで剥がしチューブに移して遠心resuspendする。resuspendした細胞はすぐに全量蒔かずに１〜２分置いて、大きな塊を下に落とす。下に溜まった大きな細胞を塊取らないように上だけとって次のdishにpassする。 これをexpandの時に繰り返せば、簡単にクオリティーの高いPEFが大量に取れます。 ポイントは、、、最初にトリプシンを絶対に使わない。その時にある程度残る細胞塊を気にしない（後で除去できるから）、です。

(無題) 削除/引用 No.2527-7 - 2010/05/14 (金) 11:53:11 - ysb >[Re:6] モンシロウさんは書きました : > DNaseは使ってないのですか？ 使っていませんでした。試してみたいと思います。 >[Re:5] JJさんは書きました : > 過剰な細切とトリプシン処理によって、細胞が溶解していると思われます。 私は時間をかけて、かなり細かくしてしまっていました。トリプシンの処理時間も含めて、素早くやってみたいとおもいます。

役に立つかはわかりませんが 削除/引用 No.2527-6 - 2010/05/14 (金) 00:20:15 - モンシロウ DNaseは使ってないのですか？ トリプシン処理後ゲノムDNAのせいで デロデロになりますよね。 これをDNaseで分解すれば上清はサラサラになりますよ そしたら上清を除去できると思います。 収量も上がるだろうし、一度試してみてはいかがでしょうか

(無題) 削除/引用 No.2527-5 - 2010/05/12 (水) 15:40:29 - JJ 過剰な細切とトリプシン処理によって、細胞が溶解していると思われます。 胎仔は頭を内蔵を取った後はさみで細かく刻みますが、はさみは新しい切れ味の良い物を使い、あまり細かくしすぎず短時間で終わらせることが重要です。トリプシン処理はmnfさんと同じく15分でやっています。 DMEM(+FBS)で希釈したらよくピペッティングして、しばらく静置し大きな塊を沈殿させます。上清を別のチューブに移し、遠心後再度DMEMに懸濁してディッシュに撒きます。小さな塊は気にしなくても培養しているうちに広がっていきます。残った大きな塊はPBS-EDTAで洗った後、もう一回トリプシンをかければさらに細胞を回収することが出来ます。 ストレイナーは細胞数の減少の原因になるので、このケースではお薦めしません。重要なのは完全に細胞をばらばらにすることではなく、手早く培養に持っていって細胞へのダメージを少なくすることです。最後までトリプシンで処理できない組織がある程度残っても、増殖の良い細胞が得られれば培養によって収量を増やすことが出来ます。

(無題) 削除/引用 No.2527-4 - 2010/05/11 (火) 21:48:44 - ysb >[Re:3] えさんは書きました : > 念のために確認しますが、DMEM+10%FBSですよね？ はい。培地はDDMEM+10%FBSを用いています。 透明なものは、私もDNAのような気がするのですが、普通はトリプシンの後は どのような状態になっているのでしょうか？ 上清はスムーズに除去できるものなのでしょうか？ > まずは遠心前にセルストレーナーを使われてはいかがでしょうか？ 一度試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2527-3 - 2010/05/11 (火) 12:55:38 - え >トリプシン処理後、透明な粘着質のものが浮いており DNAですかね？ FCSで中和されてるか私も同意見で気になります。

(無題) 削除/引用 No.2527-2 - 2010/05/11 (火) 12:18:07 - mnf 念のために確認しますが、DMEM+10%FBSですよね？ 当方では0.25%Trypsin-EDTA 5ml/2匹/15ml tube 37℃15分振盪、 MEF培地を添加して反応停止後セルストレーナーで濾過、 濾液を遠心後再懸濁して播種しています。 まずは遠心前にセルストレーナーを使われてはいかがでしょうか？

MEFの作製が上手くいきません 削除/引用 No.2527-1 - 2010/05/11 (火) 11:23:01 - ysb ＭＥＦを作っても多くが死んでしまい、生存率が低く、困っています。 方法としては、 １．妊娠13日の胎児を、抗生物質入りＰＢＳ中で細かくはさみで切り刻む。 ２．15ｍｌチューブに回収し、0.05％トリプシンを加え、37℃、30分振盪。 ３．Ｄ-ＭＥＭを加え、1100rpm、4℃、5分遠心、上清を除去。 ４．もう一度同様にトリプシン処理を行い、Ｄ-ＭＥＭを加え、遠心、上清除去後、Ｄ-ＭＥＭに懸濁し、10cmシャーレに全量まく。 全工程で4〜5時間かかってしまいます。 また、トリプシン処理後、透明な粘着質のものが浮いており、上清を除去できません。 何か工夫されている点や、コツなどありましたら、些細なことでもいいので、ぜひ教えていただきたいです。 よろしくお願いします。

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