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(無題) 削除/引用 No.2523-12 - 2010/06/08 (火) 07:12:03 - suisui ma 様 気づくのが遅くなりました 大変ありがとうございます 長時間飢餓にすると逆に差を指摘づらくなるのですね また、アミノ酸はやはりca mg入りということですね どうもありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.2523-11 - 2010/05/21 (金) 20:05:34 - ma 失礼しました。 Sigma EBSS (E2888)です。 金属入、フェノールレッド入りです。 フェノールレッドはなくても良いので、タイムラプス等を行いたいのであれば、 組成は同じでフェノールレッドなしのもあります。

(無題) 削除/引用 No.2523-10 - 2010/05/21 (金) 20:03:05 - ma EBSS (E2888) で問題ありません。 Hank'sはpHを考慮しないと行けないかもしれません。特に長時間飢餓なら。 私の経験だと今のところ６時間でも死ぬ細胞に出会ったことはありませんが、 あまり飢餓をかけすぎるとかえってLC3IIなどの差が見えずらくなることがあります。 （特にMEFはそこが顕著です。ライソゾームで分解されてしまうから。） 二時間ぐらいがスタンダードだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2523-9 - 2010/05/17 (月) 22:27:11 - suisui ara様　どうもありがとうございます 申し訳ございませんちゃんとca Mg 無しと書かれていますね 私の勘違いです　大変失礼いたしました ara様もCa Mg無しでの培養をされたことがあるのですね Ca Mgは細胞接着に関係があるとは聞いたことがあるのですが そうだとしても短時間で細胞が生存できないものなんですね さまざまな条件を行いたいと思います どうもありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.2523-8 - 2010/05/17 (月) 01:03:41 - ara suisui様 書き方が分かりづらかった様ですみません。 私はCa、Mgが入っているHanksを使用しております。 Ca、Mgなしの場合には、細胞が2時間持ちませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2523-7 - 2010/05/16 (日) 14:04:23 - suisui ara様　どうも有り難うございます ara様はMg Ca無しで行われているということですが何か理由などございますか？もし差し支えなければお教え頂けないでしょうか？ おっしゃる通り一概に飢餓ストレスといってもさまざまな条件があり目的の飢餓ストレスにより条件を設定するべきだと思います positive controlとしてDNA damageを加えた時はさほど細胞に肉眼上damageはなかったのですがうまくオートファジーの誘導が出来ていました。しかしアミノ酸ストレスは今までのところあまりに早く細胞にdamageが来るのでtime pointの設定に難渋しているところです　繰り返しtryしていきたいと思います

(無題) 削除/引用 No.2523-6 - 2010/05/16 (日) 13:28:59 - ara MEF細胞ではないですが、私もCa、Mg入りFBSなしのHank'sで2時間飢餓処理を行っていました。 どの状態がベストかは、細胞の種類や状態によっても異なりますので、 何点か条件を検討するのが一番です。 また飢餓条件でFBSを入れたり入れなかったりするのは、 見たい飢餓に依存するのだと思います。 これも細胞によりますが、血清飢餓でオートファジーが誘導することもあります。また、特定のアミノ酸の除去のみで誘導されることもあります。 ですので、suisuiさんが、何の飢餓（枯渇）によるオートファジーを見たいかによって培地の条件も変わってくるかと思います。 具体的な提案ではなくすみません。 研究は進めば進むほど不明な点が出てきますが、 頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.2523-5 - 2010/05/16 (日) 13:01:27 - suisui neko 様　 お返事が遅れて申し訳ございません。御丁寧にどうも有り難うございます その後論文を見ましてもhank`s （もしくはeagle） solutionにはFBSを入れていないと書いているものもありますね 当然の事として受け入れられている？ためか詳しく書いていないものもありますね その後HCT116細胞などで試しても驚くことに３０分で細胞は小さい円形になりほぼ死にかけている様にみえます 恐らくいずれの細胞でも結局は細胞はこれらの飢餓条件だと（推測ですが）死ぬことになるのでしょうが MEFは次回試す予定でありますが皆様が評価をする時間は肉眼的にはまだ元気な状況でタンパク抽出や電子顕微鏡の評価をされているのでしょうか（あたりまえとは思いますが）。当然細胞がdamegeを受けるとは思うのですがdamegeを受けていながらも死にそうではないというtime pointの選択が難しいなと思っています。 いかんせん今回初めて実験を行い、予想と（予備知識がないこともあり）あまりにも細胞が死んでしまうために驚いております 少しは調べて研究を始めたつもりですが次々と不明な点が出てきております申し訳ございませｎ

(無題) 削除/引用 No.2523-4 - 2010/05/13 (木) 09:24:59 - neko MEF細胞ですが、初代培養ではなく、不死化MEFで実験しています。 HanksはSigmaのH9269を使用しています。このHanksにはたしかCaやMgが含まれていたと思います。HanksにはFBSは加えていません。 あと注意することといえば、細胞の状態が悪かったりDishに増えすぎている状態だったりすると栄養条件と飢餓条件の差が出にくいので気をつけたほうがいいですよ。MEFとかは細胞が増えるのも早いですから。

(無題) 削除/引用 No.2523-3 - 2010/05/12 (水) 22:24:37 - suisui neko 様どうもありがとうございます 2-4時間なのですねどうもありがとうございます 確かに6時間という論文もありが細胞により異なるのは当然ですね neko様のご意見を参考にそれぞれtime pointを確認して細胞ごとに条件を設定しようと思います 申し訳ございません　今少し質問をさせて下さい �@細胞に関して MEFを使用している論文も結構見受けられますが　これはみなさん初代培養されているものを使用されているのでしょうか 当研究室には不死化MEFがありますがこれを使用されている方もいらっしゃるのでしょうか？ �A条件に関してコントロール：Cellgro社のDMEM(MT-10-013-CV: L-Glutamine, 4.5g/L Glucose Sodium Pyruvate入り）　10% FBS 飢餓条件:GIBCO社Hank's solution (14170: カルシウム　マグネシウム無し） Hank'sにはFBSを入れられていますか？ 当研究室にたまたまHanksがあったのですがカルシウム, マグネシウム無しでした。controlには入っているので当然入っているのを使うべきと思いますが そのほかご意見がございましたらどうぞ宜しくお願い致します

(無題) 削除/引用 No.2523-2 - 2010/05/11 (火) 09:18:52 - neko 6時間飢餓条件ではさすがに細胞は死ぬかも知れませんね。 私の場合細胞はMEFや、NRK、A549細胞を使っています。栄養条件はRPMI/10％FCSにして、飢餓誘導する際はhanks solutionにしていますが、その時間は２時間〜せいぜい４時間くらいまでにしています。 hanks solutionは培地ではなくてPBSみたいなものと理解したほうが良いと思います。

オートファジー 飢餓条件 削除/引用 No.2523-1 - 2010/05/10 (月) 15:08:44 - suisui お世話になっております オートファジーの研究をさせていただいているものですが　その際飢餓ストレスを加えたいと思っております　 条件としてアミノ酸freeだと思うのですがほかの論文を見ましたところEagles solution や　Hank's solutionを使用しているのが多いと思いますが予備実験をしたところ６時間で全て細胞は生存不能になっておりました 基本的な質問で申し訳ないのですが これらのsolotionのほかに10%FBSとglucoseは加えておりますがほかにも加える必要があるものでしょうか。　またhanks solution やeagle solutionでは細胞は６時間で死んでしまうのでしょうか（もちろん細胞によって異なるとは思いますが） 申し訳ございませんが宜しければ御教授頂ければと存じます

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