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(無題) 削除/引用 No.2506-30 - 2010/08/14 (土) 03:42:43 - 310 310ですが、数週間前にボスからGENESCANの消耗品を購入する指令が出て、先週より稼動しています。Filter FにABIのサービスの人が入れたMatrixを当てて解析していますが、FAM（ボスの意向でFAMしか使えません。シグナルの強さが高いからと言っています。ちなみに私は373で4色蛍光のLinkage Mapping Setを1レーン平均12PCRプロダクトで使っていましたが、このことを話しても無駄でした。）のピークがYellowとGREENを引っ張ってしまっています。 私が来る前に受注したプライマーで、ボスに聞いてもFAMが6-FAMか5-FAMか分かりませんので、ABIのサポートに相談中です。 さて、何回かゲルを代えながらGENESCANを泳動中なのですが、10サンプルを越えたあたりからになるにつれ泳動速度が早くなり分離能が低下します。再泳動でサンプルは問題ないことが分かりました。バッファーは毎回変えポリマーも72時間以内に交換しています。シリンジもポリマーを少量入れて中を洗って排出後、新しいポリマーを入れています。私はシリンジがゆるくなっているので、これが原因かと思い新品のシリンジを購入する予定ですが、皆様の中で同じような症状にあった方はいらっしゃるでしょうか？ 余談ですがポストの更新は無事完了しました。ただボスのグラントが当らないためラボが来年3月まで持つかどうか分からなくなりました。アメリカの研究費は結構学歴重視なので、ボスの評価点は”研究の進め方”を除き高得点ですが、レビューアの指摘をまともに読むこともせず、相手が自分のやりかたを嫌いなだけだと言っています。彼は勿体無いほど優秀な経歴と、高い体力と記憶能力を持っていますが、頑迷な点のみ惜しまれます。

(無題) 削除/引用 No.2506-28 - 2010/05/17 (月) 16:52:42 - BW レスが落ち着いてしまっていますが… 310さん、大変そうですね。 ポストが無事更新されたのかも気になるところですが。 私は310をsequencingではなく、genescan用（つまりgenotyping)に使っています。 あくまでもその経験ですが、1本のキャピラリで大体500runまでは行けます。 マニュアルにはバッファーは2日に1回の交換で良い、となっていますが、毎日交換した方が良い、とサポートの人が言っていました。 あと、レーザーが当たるガラスの部分を、99.5%エタノールをキムワイプに含ませて拭いてあげます。 これは2日に1回くらい。これでベースラインが一気に下がって安定します。 コストについてですが、バッファーは純正は高いので、違うものを使っています。 A.C.E.TM Sequencing Buffer(CE Running Buffer 10XConcentrate)

共存 削除/引用 No.2506-27 - 2010/05/10 (月) 15:29:00 - ema やった事ある人に聞きましたが、ショート（である限りは）＋GeneScanは何も換えず読めます。 キャピラリー交換100ってありますが130くらいは全然で160くらいで変な感じがすることもあるので換えてます。310のキャピラリーは壊れる（よっぽどでないと）用な作りではないのでそこは不安に思わなくていいです。（3100の96タイプ、3130の16本タイプ,Megabaseのキャピラリーは怖い。不良品あったし空気はいる確率結構あるし。310ではそんなことはないです。手順多いけどすぐ慣れます） 価格なんですが、受託は反応試薬（計算って反応試薬の割り算ですよね）＋プレートチップ代＋精製＋ロードゲル、バッファー＋メンテナンス費だとおもうので、受託した方がいいような。 あと保守のレベルがちがうかもしれませんが、日本で約90万の保守を結んでますがこれにはレーザー代が入っていません。年１回のキャリブレーションと清掃メンテ、バージョンアップとか故障があった時はすぐ来てくれて高くない機材はそのまま交換なんですが。$5000はどこまでなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.2506-26 - 2010/05/08 (土) 12:53:27 - さとし かなり想像を絶するABI310の使い方だったのですね、、、 600base以上読みたいシークエンス１００反応分は 今の3XXXならキャピラリ４本でも丸一日かからないのに １０日以上かかるわけですから、、、 う〜ん頑張ってくださいとしか言えませんが フル稼働してもデータの出が遅くなるのは明らかですから ボスも実際動き始めたら考え直すかもしれませんね

(無題) 削除/引用 No.2506-25 - 2010/05/08 (土) 11:58:57 - 310 ボスから返事が来ました。 You calculation is wrong. The running cost is the same regardless of instrument. Also our cost for reagents will be the same as a large sequencing center. Also, you do not know the dilution that they use at UC Davis. I AM POSITIVE ABOUT THIS. I WENT THROUGH IT WITH THE REP SEVERAL TIMES. 自信がありそうなので、反論せず従うことにしました。保障契約によって何もしなくても年間$5000が出て行くので、余程節約できるみたいです。 たとえばキャピラリの寿命を延ばせたりはできるのでしょうか？100runで交換はちょっと短いような気がします。昔、Beckmanの八連キャピラリを折ってしまったトラウマがあるので、できるだけ交換は少しで済ませたいのですが。 また短いキャピラリとPOP4の組み合わせでGENESCANと短い配列のシーケンスの両方ができるようですが、このときもキャピラリを外したり付けたりが必要でしょうか？スイッチの切り替えや泳動条件の変更は必要みたいです。GENESCANとシーケンスの混在使用はできないと聞いていて、名大に310が2台入った際も片方はGENESCAN専用、もう片方はシーケンス専用でした。GENESCANの予約単位が2週間だったことが、このスレッドで勉強させていただけたおかげで、やっと分かりました。 ＞昔のuser様 お褒め頂きありがとうございます。性分なので仕方が無いのです。試薬買うときも時間がかかるので、自分でも嫌なのですがどうしようもありません。

(無題) 削除/引用 No.2506-24 - 2010/05/08 (土) 10:40:34 - 昔のuser 本題とは関係ないですが、３１０さんはえらいですね。大抵は、そんなことはボスの仕事で私は使うだけ、コスト計算なんかはとてもとても、となりがちです。日本でもそうですが。私自身も、海外でポスドクしてたとき、高いとか安いとかはいいましたが、そこまでのケアはした記憶がありません。応援したくなりました。

(無題) 削除/引用 No.2506-23 - 2010/05/08 (土) 04:25:33 - 310 ザンギ様 計算してみました。POP4ポリマー、shortキャピラリ、BigDyeVer3.1&Xtream kit(DNA Sequencing, Rox500 sizestanadard(GENESCAN)は入ってますが、レーザー、シリンジ、Cap＆Plate、バッファー、GENESCAN用フォルムアミドは入っていません。Big Dye Xtream kitは、AP様のご意見からサンプル保存がフォルムアミドより持ちそうで、大量サンプル向きかと思い選択しました。 ちなみに今の委託は、Templateを持っていけば、メール添付で解析済みデータになって返ってくるので、非常に楽です。時々、泳動失敗や特殊な配列で読めないこともありますが、これも言えばベタイン入れたり再泳動してくれます。 データは数日以内に届きます。車で片道45分かかるのが最大の欠点です。 GENESCAN 1plateで$168かかります。委託だと$100-150で1plateをやってくれるので、委託が安いです。 DNA Sequence 20ul、8倍希釈で$4.05です。10ulで$2.65になり受託の$4.50/sampleを下回りますが、多分下限ぎりぎりの条件だと思うので、私達の調べる配列でうまくできるかはやってみないと分かりません。何より425bpが限界というのは、今後問題になってくるでしょう。 管理の手間、レーザの消耗または年間$5000のサポートがかかることを考えると損してしまうので、今一度ボスにメールでABI310の購入または保障修理自体の撤回をお願いしました。あまり言うと君のポストの維持で僕がどんなに苦労しているかと言い出すので、あまり強く言えません。 断られたら、とりあえずPOP4とshortキャピラリで頑張ってみます。とは言え私のポスト更新まで18日しかなく、何回聞いてもとにかく待つことと言われているので、頑張る機会も得られず失職＆日本に帰ることになるかもしれません。 ご意見をくださった皆様どうもありがとうございました。

気持ちの問題で 削除/引用 No.2506-22 - 2010/05/07 (金) 20:08:46 - ema ミリポア　プレートMDRLN0410に自力詰めでSephadex G-50 Fine 500g17-0042-02を入れる方法なので再利用は可です。これはワットマン7700-2801、7704-1002も同じ。 遠心条件というか遠心の機械とか、同じものでもロット違いで溶出液量の違いとかがけっこうでます。ゲル捨ててもすごくはきれいにならないし、もしコンタミした時判定と時間ロスが面倒なので再利用はやめました。 あと、根本的な話ただのシークエンスはゲルはpop6、ショート、ロングキャピラリー（うちはロングに統一して泳動時間の設定を短いものは数値を短く換えて取り替えずにやってます）解析ソフトはSeqencescannerです。GeneScanはpop4、ショート、解析ソフトはGenMapperでマトリクスの調整も別だった気がするので共存させるのは難しい気が、、、。まるで専用オペレーターみたいにこれに力注ぐんならともかく、本筋の実験の進みに影響出る気が。

(無題) 削除/引用 No.2506-21 - 2010/05/07 (金) 19:39:07 - 通りがかり 横ですみません。 emaさん、 ミリポアのマルチスクリーン96穴は再利用可能と聞いているのですが、いかがでしょうか？　現在この方法の採用を検討しておりまして、経験や感想を教えていただければ幸いです。 BigDyeのコスト計算ですが、濃度の希釈に加え、反応容量を減らすともう少し安くなりそうですね。

うちでは 削除/引用 No.2506-20 - 2010/05/07 (金) 18:45:49 - ema 310,3130xで大量にやっています。 Dyeはv1.1（GCにはいまいちだけどきれいに）v3.1（難しいのに強いけどハイピークが最初かぶる）の使い分けをしてます。 反応試薬は×４で、日本だと1,000reaction売り1,000,000円でけちって250円くらいの計算。 セファデックスG50濾過（ミリポアのマルチスクリーン96穴）のみ精製で水のまま（ホルムアミドにしない）denature95℃やってきれいに出てます。 日本円での話ですがさらにケチるとミリポアをワットマン製にかえると一サンプルあたり計算上精製費ワットマン\42.4ミリポア\70.3ABI試薬\159.6（ロスはあるからもうちょっとかかるけど） ただこの方法、遠心条件が重要だったので、遠心機がやばい、って発言があったきがしていままでコメントしてませんでした。 どっちにしても310オンリーだときつい。 96穴いっぱいなら反応までかけてくれる受託の方が安い事は多いので、受託勧めですね。

(無題) 削除/引用 No.2506-19 - 2010/05/07 (金) 16:28:15 - ザンギ 310は使ったことないのでコストを計算して比較したことがないですけど、 受託解析でも数がまとまるとコストはかなり安くなってると思います。 アメリカならなおさらのことそう思います。 自前で解析する場合の消耗品費の見積もりと受託解析の見積もりの比較を されてみてはどうでしょう。 ラボにシーケンサがあると少数の解析を手早くやるのにはいいのですが、 多検体になると大変です。

(無題) 削除/引用 No.2506-18 - 2010/05/07 (金) 15:21:46 - 310 通りがかり様 ご情報ありがとうございます。私はSAP処理なしで、教えていただいたカラムとほぼ同じものを作り、ベックマンの8連キャピラリシーケンサでDNA配列を読んでいたことがありますが、良好でした。しかし、ベックマンのときは低温遠心乾燥機で乾燥させてからホルムアミドに溶解していたのですが、今のラボ（周囲のラボも含め）にはありません。なのでエタ沈した後、アルミホイルをかぶせ、ドラフトで気長に乾燥させようかと思っている次第です。 みみ様 私も310のデモを昔見たときキャピラリ交換のめんどくささを感じました。ですので、一度キャピラリを取り付けたらできれば寿命が尽きるまで、同じものを使い続けたいとは考えています。実験の進行速度にもかかわる問題ですので、ラボの全員で話し合い（もしボスが許せば）外注と310処理を使い分けようと思い始めています。

(無題) 削除/引用 No.2506-17 - 2010/05/07 (金) 14:21:36 - AP 310で多検体を処理することの是非はおいておいて、 HiDiで溶解したサンプルを長時間放置したときのデータ品質の劣化は、ヒートディネーチャーしてから時間がたってしまい、変性状態が保たれないからということも一つの理由だと思います。 その点、Xterminator処理したサンプルは泳動に先立つヒートディネーチャーが不要で、しかも室温で少なくとも2日は安定ということなので、多検体を同時に調製してスタンバイしておくのにも有利です。 まわし者っぽくなってますが。

(無題) 削除/引用 No.2506-16 - 2010/05/07 (金) 13:44:58 - 通りがかり 理屈上では、エタ沈精製の代わりに、SAP処理+セファデックスG50濾過（ミリポアのマルチスクリーン96穴）だとかなり省力化できます。機材があれば、コストも安いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2506-15 - 2010/05/07 (金) 11:49:39 - Pumpkin >一度に1000サンプルとは驚きです。 >ピークのS/N比がどんどん悪くなるということを経験しているので一度の測定では30サンプル以下に抑えています。 これらの意見に賛成です。多くても半分位の40サンプルまででやっていました。機械の動作熱でHi-Diがとぶのかなぁと思っていました。現に容量減っていますし。室温はコントロールされているでしょうが、それでも機械内はほぼ密閉になるので熱はこもるのでしょう。 トピ主さんに課せられたデューティーはちょっと310では過酷というか、やはり、無理な領域かと思います。 エタ沈じゃなくてカラムかつ、少しでも安くということであればSigmaSpin™ Sequencing Reaction Clean-Up　96-well post-reaction clean-up platesというのがあります。2プレートで３万円位。1prepあたり160円位ですね。ご参考までに。

ご苦労様です 削除/引用 No.2506-14 - 2010/05/07 (金) 10:00:47 - bluehornet 310さん、ご苦労様です。 私は時折ABIの310でGeneScanを行っていますが、一度に1000サンプルとは驚きです。 私の場合はPOP4,47cm,DS-33の系でサイズマーカーにLIZの600を使っています。測定に1サンプルあたり約30分はかかります。1000サンプルだと500時間を超えてしまいますね。半分の300b.p.まで読んだとしても連続運転で10日以上かかります（そもそもサンプルトレーは96サンプルまでの対応だったと思いますが・・・）。なんだか、無茶な気がしますが大丈夫でしょうか？ また、サンプル数が多いと測定の順番が後の方ではサイズマーカー及びサンプルの蛍光強度が落ちてきて、ピークのS/N比がどんどん悪くなるということを経験しているので一度の測定では30サンプル以下に抑えています。おそらく、Hi-Di Formamideの経時的な変化だと思われます。ピークが「出る・出ない」の判定だけなら影響はそれほどないと思いますが、ピークの強度で半定量などをしておられるならば、やはりサンプル調製から測定までの時間を短くするためにmulti-capillaryを検討した方がいいと思いますよ（頑固なボスがもう310を買っちゃったんだから難しいとは思いますが・・・）。 ご健闘をお祈りいたします。

(無題) 削除/引用 No.2506-13 - 2010/05/07 (金) 09:25:18 - みみ 数年間310を管理・運用していました。 100とかの単位を310で処理するのは現実的に難しいのでは？確か短い方で1h/本，長いのでは2.5h/hくらい掛かりますよね？つまり短い方でも1日に24本しか読めません。また，使用者によってポリマー・キャピラリを交換となるとさらに時間が必要になります。これはかなり手間がかかる作業で，時間もかかります。反応どうこうよりそちらの方が問題になると思います。 ちなみに私は急いで数本読みたい時だけ310を使い，大量サンプルの時は外にお願いしていました。

(無題) 削除/引用 No.2506-12 - 2010/05/07 (金) 06:55:51 - 310 ぶん様 一度にシーケンスする数は、100-300反応です。GENESCANは数百が標準で時には1000近くなります。明らかに310の処理能力を超えていますが、ボスが頑迷な人で何度言っても聞き入れてくれませんでした。 したがって、精製だけでも一括処理して、時間の減少に勤めたいと思っています。ABIのマニュアルでは1400-2000 × g for 45 minでBig Dyeのエタ沈を行えると書いてあるため、はじめはこれを参考にして実験を行うつもりです。できれば沈殿の引っ付きのいいプレートを使って、サンプルロスを減らしたいのですが、どのプレートがいいやらさっぱり分かりませんので、このスレッドで少しでもご意見をいただければと思っております。 薄め液八倍もボスが言い出し、私の意見を聞き入れません。これに関してはBig Dye濃度を振ったデータを出して考えてもらおうと思っています。過去にボスのラボには310があったらしく、話だけはいくつか聞いていたようで、そのことも話を聞いてくれない原因のひとつです。ところで、どうも譲ってもらった310はトラブルを抱えているらしく、今日まで4日連続でABIのスタッフが修理に来ていましたが、まだ直りません。皆様のご意見を試すことができず残念です。

(無題) 削除/引用 No.2506-9 - 2010/05/06 (木) 17:32:50 - ぶん 1.5mlのチューブに移して遠心するのが一番安全なのではないでしょうか？ キャピラリー１本だと一日に泳動出来る数も限られてくるのでそれほど 大変でもないでしょうし。 >す。ただ試薬濃度に関してはキットの薄め液と http://www.fujita-hu.ac.jp/~hinagaki/tips/dilutionseq.html に乗っている液を使い8倍希釈で始めようと思っています。 いきなり８倍はちょっとチャレンジャーなのでは？と思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2506-8 - 2010/05/06 (木) 03:40:32 - 310 AP様、申し訳ありませんでした。たしかにあなたのおっしゃるとおりでした。以降気をつけます。 ぶん様、いい遠心機をお持ちでうらやましいです。うちの遠心機はもう軸が狂っているのかバランスをとっても2000rpm超えると、異音がします。あと、ぶん殴らないと動かないことが多いです。お金が無く壊れたら修理も買い換えもできないので、なるべく手加減して殴っています。多分遠心機の蓋をロックする装置の接触不良だと思うので、私に機器修理の知識があれば何とかするのですが、機械の修理をしたことが無いので、掃除したり油を差したりしてあげるのが精一杯です。 昔のuser様、ボスの知り合いのラボで使われていないのを安価で譲ってもらったそうです。ソフトもコンピュータも無い310を持ってきたときは、どうするんだこれと思いましたが、ABIが一括年間サポート契約を結んでくれて、廃品同然の310が動くことになりそうです。また来てくれたサポートの人もとても親切で、本来なら駄目な事も何とかしてくれました。ちなみに今いるラボはアメリカなので、日本とサポート体制が違うのかもしれません。ちなみに310のレーザーはこちらでは$4,000だそうです。100万程度とはえらいぼったくり様ですね。 ともかく最初はできるだけ多くの方法を使ってみて、うちのラボに合うやり方を探そうと思います。ただ試薬濃度に関してはキットの薄め液と http://www.fujita-hu.ac.jp/~hinagaki/tips/dilutionseq.html に乗っている液を使い8倍希釈で始めようと思っています。

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