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(無題) 削除/引用 No.2494-7 - 2010/05/04 (火) 14:49:42 - マーシー 皆様返信遅れてすみません >APさま やはり大きな分子の発現は難しいようですね。 私の研究室でも117kDaのタンパクを発現させたことがあるようですが、やはり少量しか精製できなかったようです。 ただ、大腸菌を使った発現実験で不溶性画分になったことは無いです。私の場合発現するか、全く発現しないかの2通りにしか当たったことがないですね。まぁ、半分くらい運ということですかね？ >amiさま TOPO XL PCR クローニングキットは検討していた項目の一つでした。ただクローニング後に発現＆精製を行いたかったので悩みどころではありますね。 >DDDさま 多比良研、私はこの事は知りませんでした。 皆様のご意見を総括すると、とりあえずやってみるだけやってみて、駄目だった時はドメインごとに分割するのがよさそうですね。 大変貴重なご意見・参考をありがとうございました。

可溶化 削除/引用 No.2494-6 - 2010/05/01 (土) 23:24:13 - DDD amiさん > その結末はご存知のとおり 多比良研のアレですよ 知らないようなら、ぐぐれば… APさんも書かれていますが、クローニングはクリアしても発現させるのは難しいかと。。。 さすがに9800bpを発現させたことはありませんが、 大きなものを発現させようとすると不溶画分にくることが多い気がします。 ドメインで分割するとかどうでしょう？ まぁ分割して意味がない実験ならダメですが。。

(無題) 削除/引用 No.2494-5 - 2010/05/01 (土) 22:07:41 - ami たびたび名前が挙がってますが、TOPO XL PCR クローニングキットは助けになるんじゃないかなぁと思います。 > その結末はご存知のとおり 何があったんですか（汗

(無題) 削除/引用 No.2494-3 - 2010/05/01 (土) 21:16:57 - AP >その全長9800bpもあります。この長さのInsertはVectorサイズよりも大きく、Ligationできるかわかりません。 それくらいの長さのinsertなら無理ではありません。もっと大きなinsertのクローニングだって珍しくありません。 >尚かつVectorにLigationし、タンパク発現を行う予定ですが、大腸菌で発現できるか解りません。 大腸菌でタンパク質発現をおこう場合、おおよそ100 kDaが限界だというのがコンセンサスだと認識しています。それでも可溶化発現は稀、多くの場合、不溶性でも完全長の発現は難しいと思います。 >これだけ大きな分子をクローニング、発現したことがある研究者の方はいらっしゃいますでしょうか？ 200 kDaものタンパク質を発現させたという報告がありますが、 ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC149204/ その結末はご存知のとおり。そんなでかいタンパク質を大腸菌で発現させて取得したなんてうそだろう、と多くの研究者の疑惑の目を集めてしまったポイントでもあります。

巨大Insertのクローニング＆発現について 削除/引用 No.2494-1 - 2010/05/01 (土) 18:26:41 - マーシー いつも勉強させて頂いてます。 今回Insertをクローニングしようと考えているのですが、その全長9800bpもあります。 この長さのInsertはVectorサイズよりも大きく、Ligationできるかわかりません。 尚かつVectorにLigationし、タンパク発現を行う予定ですが、大腸菌で発現できるか解りません。 これだけ大きな分子をクローニング、発現したことがある研究者の方はいらっしゃいますでしょうか？ もし、何かアドバイスなどお気づきの方がいらっしゃいましたら、ご教授願えませんでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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