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(無題) 削除/引用 No.2493-7 - 2010/05/01 (土) 14:06:10 - 恐縮です あべちゃん様 色々と有難う御座います。 >GL3バックボーンのなかに目的転写因子が強く作用するシスエレメントが含 >まれていることを懸念されているのであれば、 それが質問の本意でした。 舌足らずで申し訳有りません。 たしかにa値やb値の2倍程度の差は 誤差範囲のような気もします。 (コントロールとして用いている phRL-TKの値にはほとんど差はありません。） しかし、無視もできませんので なるべくa値とb値の差がでないような条件で >GL3 (mock)/pRL (mock) >と >GL3 (転写因子)/pRL (転写因子) で比較しようと思います。 御指導有難う御座いました。

(無題) 削除/引用 No.2493-5 - 2010/05/01 (土) 13:37:10 - あべちゃん 恐縮さんが、pGL3バックボーンのなかに目的転写因子が強く作用するシスエレメントが含まれていることを懸念されているのであれば、 たしかに A/aとB/bを比較する必要があるかもしれないですね。 pGL4は、pGL3よりもそういった意図しないシスエレメントになりうる配列をとことん排除したベクターらしいですよ。私自身は使ったこと無いですが、どうしてもpGL3バックボーンだけで、影響が強いなら、模索する必要があるかもしれません。 私見ですが、しかし、aとbとが2倍というのはレポーターアッセイでは、誤差レベルなんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.2493-4 - 2010/05/01 (土) 13:33:02 - あべちゃん >[Re:3] 恐縮ですさんは書きました : > たとえば、a値がb値の約2倍になってしまっていた時に > A値もB値の2倍となった場合に > 「プロモーターPは転写因子Tによって2倍転写活性が上昇した」 > と判断できるものなのでしょうか？ > （A値とB値はそれぞれa値とb値の約100倍くらいです） 転写因子を発現させたことで、非特異的に転写活性化能が上昇した分をどう考慮するか？ ということであれば、 Dual Luciferase kitをお使いなので、pRL系のベクターから発現したレニーラ由来ルシフェラーゼの発光量で補正するのだと思います。 従って、 pGL3 (mock)/pRL (mock) と pGL3 (転写因子)/pRL (転写因子) の数値で比較するのが一般的だと思います。 この際、pRLの値が変動する場合があるので、変動しない条件を探すことが、前実験として必要だと思います。それは、 1) pRLの種類を変える：pRLベクターには幾つか別のプロモーターを組み込んだものがあります。目的の転写因子による影響がないか、少ないものを探す必要があるでしょう。phRLという新しいベクターも売られているようです。 2) pGL3/pRLや転写因子発現用ベクターをトランスフェクションする際の比率を変える です。

(無題) 削除/引用 No.2493-3 - 2010/05/01 (土) 13:20:13 - 恐縮です あべちゃん様 御意見有難う御座います。 わかりにくい書き込みで申し訳有りませんでした。 当方としては転写因子に注目しております。 ただ実験系にまだ問題があるのか、 たまに、先の書き込みでいうところのa値とb値に 差が出てしまうことがあります。 たとえば、a値がb値の約2倍になってしまっていた時に A値もB値の2倍となった場合に 「プロモーターPは転写因子Tによって2倍転写活性が上昇した」 と判断できるものなのでしょうか？ （A値とB値はそれぞれa値とb値の約100倍くらいです） 説明力が足りずに大変申し訳ありませんが、 よろしければまた御意見ください。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2493-2 - 2010/05/01 (土) 08:24:42 - あべちゃん 恐縮ですさんの意図をちゃんとフォローできたか不確かですが、 A/Bで出た数値を用いて、「プロモーターPは転写因子Tにより、x倍転写活性が上昇・減少した」と論じるのではないでしょうか？ プロモーターに注目しているのか、転写因子に注目しているのかによって変わると思います。

レポーターアッセイの結果の解析方法 削除/引用 No.2493-1 - 2010/04/30 (金) 21:56:51 - 恐縮です いつも参考にさせて頂いております。 レポーターアッセイの結果の解析(計算)方法について 少し悩んでおります。 promegaのdual luciferase assay repoter assay systemを 用いて、目的とする遺伝子のプロモーターの活性が ある転写因子の過剰発現により変化するか否かを調べています。 pGL3-basicベクターと転写因子発現ベクター(あるいは空ベクター) をco-transfection行った際の計測値がそれぞれ a、bとして、 目的とする遺伝子のレポータープラスミドと転写因子発現ベクター(あるいは空ベクター)をco-transfection行った際の計測値をA,Bとした場合、 転写因子発現ベクターと空ベクターとの活性の差は A/a,B/b(basic vectorの値で割ったもの)の比で比較するべきなのでしょか？ それともA-a,B-b(basic vectorの値を引いたもの） で比較するべきなのでしょうか？ レポータプラスミドは目的遺伝子のプロモーター領域を pGL3-basic vetorに組み込み、作成しました。 幸いaとbにはあまり差がない(どちらもRLU 1000程)なので、 結果に大きな違いは出てこないのですが どちらの計算結果を正式なものとするか、迷っております。 素人ですので、的を外した疑問かもしれませんが よろしく御指導下さい。

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