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(無題) 削除/引用 No.2492-8 - 2010/05/11 (火) 19:04:12 - ホネ う様 とりあえずコントロールとしてのルシフェラーゼが発現しているか、ルミノメーターで検出してみようと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2492-7 - 2010/05/06 (木) 11:20:57 - う そもそも、コントロールにルシフェラーゼがあるのは、 ルシフェラーゼアッセイをして確かめようってことではないでしょうか。 主観ですが、ルシフェラーゼアッセイは感度高いですから。

(無題) 削除/引用 No.2492-6 - 2010/05/06 (木) 09:12:30 - ホネ 私も素人なのですが様 ウチのラボにはルシフェラーゼの抗体がないみたいなので確認できていません；ＣＢＢで見れるかなと淡い期待を抱きましたがダメでした。 その因子のmammalでの発現はやったことがないです。とりあえずvitroでクリアしてからvivoに移ろうかと思っていたので.... う様 そうですね、とりあえず何回か条件検討をしつつ結果をみてみます。 あべちゃん様 westernで検出できるのですか....それならばやはりどこかメソッドに問題があるのでしょうねきっと。ちなみに、ルシフェラーゼコントロールと抗His抗体の下りですが、ルシフェラーゼコントロールはＣＢＢのコントロールで試しに使ってみました。抗ルシフェラーゼ抗体がないのと、発光検出の機械を動かしたことがなかったので。抗Ｈｉｓ抗体を使ったwesternでのコントロールは、大腸菌での発現が見られる違うインサートの入った同じベクターを用いました。結果的にコントロールとしては使えませんでしたが。 チェック項目の１．３はおそらくクリアしていると思いますが、プラスミドの純度ってかなりクリティカルのものなのでしょうか？マニュアルに書いてある条件はクリアしているのですが。最後に４ですが、マニュアル記載のプロトコールでは、３０℃、９０minとあってそれ通りに行ってます。条件検討をするのであればどのようにいじればいいかアドバイス頂けたら嬉しいです。 ＡＰ様 そういうものもあるんですね。情報ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2492-5 - 2010/05/01 (土) 21:52:58 - AP >in vitro translation は普通RI系で行うものなのでしょうか？ non-RIの代替法もいろいろあると思いますが、ポピュラーなのはビオチン化Lysineを使ってde novo合成のタンパク質をビオチンで標識する方法でしょうか。キットとしてはRocheから出ていたはず。

(無題) 削除/引用 No.2492-4 - 2010/05/01 (土) 08:01:13 - あべちゃん ホネさん、 TNTの系をたまに使っている者です。 合成した目的蛋白質をCBB染色で検出するのはかなり厳しいです。Promegaの説明書に予想収量が書かれていると思いますが、CBBの検出限界に近い値です。実際には、予想収量ほどのパフォーマンスが出ることが少ないので（私の場合）、CBBで検出した経験はありません。 しかし、Western blotでは十分な量の発現が見込めると思います。私の行った実験の限りで言えば、抗体がちゃんとワークする事を前提に、全ての実験で発現を確認できています。ただ、発現量はcase by caseと言ったところでしょう。 あと、ホネさんのコメントで分からなかったところは、ルシフェラーゼコントロールとHis抗体の下りですが、LuciferaseにHisタグは付いていないのでは？このルシフェラーゼコントロールを使うのであれば、ルシフェラーゼによる発光を観るか抗ルシフェラーゼ抗体を用いてWestern blotするかだと思います。 最後に、チェック項目として １）ベクターコンストラクションは大丈夫か？プロモーターとアデニレーションシグナルは、付いているか？ ２）プラスミドの純度 ３）methionineを入れていますか？ ４）反応温度と時間の至適化はしましたか？ 等が考えられます。抗Hisタグ抗体を用いたWestern blot実験はワークしているようなので、発現していれば検出できる可能性が有ると思います。

(無題) 削除/引用 No.2492-3 - 2010/04/30 (金) 22:48:46 - う ＞in vitro translation は普通RI系で行うものなのでしょうか？ RIで加えるはずのアミノ酸をコールドのやつを補って加えれば問題ありません。 ただ、その計算は面倒だと思いますが。 ただ、それはタンパク質ができるはずというだけで、検出できるか？はわかりません。 もともとreticulocyte lysate systemでは、CBBで検出できるほど量ができるものではなく、 それがウエスタンで検出できるかもわかりません。 RIだとかなーーーーり露光すればバンドとして検出されることもありますが、 それがウエスタンの系でいうところのどの程度の検出感度かは感覚的なものなので 一概には言えませんが、私は個人的にウエスタンで検出するのも結構厳しいことがある気がします。 ただ、一度reticulocyte lysate systemを使っただけの感想をここに書かれても、 実際mRNAはどの位できたのか？などなどチェックすべきところの情報が無いので 何とも言いようがない。

(無題) 削除/引用 No.2492-2 - 2010/04/30 (金) 21:00:46 - 私も素人なのですが 私も素人なのですが、１つ確認させてください。 >ところが、発現の確認ができませんでした。コントロールはシステムに付属のルシフェラーゼを発現するものを用いていて、CBBで何か変化が見られるかと思ったのですが確認できず。（そもそも推奨されていないのにこれを判断材料とすることが間違いだと思うのですが。）His抗体は他の実験で使えることは確認済みです。 そのルシフェラーゼは（CBB以外の方法で）上手く発現してくれたことは確認済でしょうか？ それからそのHis抗体の認識様式が目的タンパクの立体構造に影響受けている可能性は如何ですか？ plasmidをmammalに発現させ、his tag-因子を作らせた時、その抗体は認識できますか？ あと、RI系でなくてもやってる人は私の周りでもいますよ。

in vitro translation後のタンパク発現確認 削除/引用 No.2492-1 - 2010/04/30 (金) 20:10:45 - ホネ 素人ながらいつも参考にさせてもらってます。 ある因子について大腸菌を用いてタンパク発現を行ったのですが 発現しているのかどうかわかりません。 低温発現も試してみたのですが効果は見られませんでした。 この因子と同時に他のいくつかの因子も同時に発現を行っているのですが そちらは一応発現が確認できるのでメソッドの問題ではなく このタンパクを大腸菌が嫌がっているのか、 あるいは他の何かが原因（Zfを持っていて、あるスレではZfを持っていると発現しにくいとかいう話もありましたが...)であろうと考えました。 そこで無細胞系で行ってみようと思い、Promegaの TNT coupled rabbit reticulocyte lysate systemによって in vitro transcription/translationを行いました。 RIを扱ったことがなかったのでとりあえず、Non-RI系で行ってみました。 タンパク発現をCBB染色(マニュアルでは推奨されていませんが判断材料の一つとして一応）とWestern blot(His tag融合タンパクなので抗His抗体を用いて)を行いました。 ところが、発現の確認ができませんでした。コントロールはシステムに付属のルシフェラーゼを発現するものを用いていて、CBBで何か変化が見られるかと思ったのですが確認できず。（そもそも推奨されていないのにこれを判断材料とすることが間違いだと思うのですが。）His抗体は他の実験で使えることは確認済みです。 in vitro translation は普通RI系で行うものなのでしょうか？ あるいはただ単にSDS-PAGEでロードするタンパク量が少ないだけなのか？（反応スケールがもともと小さいのであまり多量使いたくなかった） 稚文ですが、何かお手柔らかにアドバイス頂けませんか？

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