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(無題) 削除/引用 No.2489-11 - 2010/05/01 (土) 08:09:43 - あべちゃん >[Re:1] Cirnoさんは書きました : > お世話になっております。 > 今回はChIP（クロマチン免疫沈降）後に正しくIPされているかを確認するため、Western Blottingを行う必要があるか？ないか？についてお聞きしたいと思います。 > > 私としては、クロスリンクやSDS、Sonicationなどで目的のタンパク質が変性し、またIPされる量も少ないことから、Western Blottingでの検出は不可能だと考えています。 > > 皆様はどうお考えでしょうか? > RT-PCRによる確認はできないものとします。 Cirnoさんの直接の疑問に対する私の考えは、IPチェックは必須だということです。 抗体はNativeな状態を認識するものもあるし、その逆もあると考えられます。Cirnoさんが使われている抗体がどちらなのか？或いは両方とも認識できるかについては、ご自身で確認する必要があります。 実際のChIPをする時の条件でIPし、 IPの上清と沈殿の両方をWestern blotで確認してみましょう。 上清のみに認められるならばIPが上手くいっていません。 上清と沈殿共に観られないなら、そもそもサンプリングしたlysateに目的蛋白質の存在量が少ないかWestern blotに適した抗体ではないということでしょう。 上清と沈殿共に検出できた場合は、どれくらいの効率でIP出来ているかが推定できると思います。

(無題) 削除/引用 No.2489-10 - 2010/04/30 (金) 14:52:42 - ？ では、次に質問するときは、 ＞今回はChIP（クロマチン免疫沈降）後に正しくIPされているかを確認するため、Western Blottingを行う必要があるか？ないか？ どうしてしなくてもいいか自分では思うのか？書いたらいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2489-9 - 2010/04/30 (金) 14:18:50 - Cirno ?様 そういった揚げ足取りはちょっと困ってしまいます もう少し考えをまとめ、実験をして、それでも疑問がでできたらサイド登校します。 レスをしていただいた方ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2489-8 - 2010/04/30 (金) 13:48:55 - ？ ＞もちろん自分の結果に対し否定的な視点でも肯定的な視点でも見るようにしています^^; それなら ＞今回はChIP（クロマチン免疫沈降）後に正しくIPされているかを確認するため、Western Blottingを行う必要があるか？ないか？についてお聞きしたいと思います。 こういう質問する意味がわかりませんw

(無題) 削除/引用 No.2489-7 - 2010/04/30 (金) 13:18:53 - Cirno う様 もちろん自分の結果に対し否定的な視点でも肯定的な視点でも見るようにしています^^; ＞サンプルの量を多くすれば、いいじゃないですか？ はい。実際に量を増やして行っています。結果は検出できずですが^^;

(無題) 削除/引用 No.2489-6 - 2010/04/30 (金) 12:36:54 - う う〜ん。これまた言葉遊びをするつもりはないのだが、するしかないので書きます。 ＞クロスリンクやSDS、Sonicationなどで目的のタンパク質が変性し、 もし、ここで変性しているのを心配するのであれば、 どうして目的DNAとそのタンパク質が「結合したままでいられる」と考えるのか？ もちろん、DNAとタンパク質がリンクされた後、タンパク質だけ形が変化し 抗体は認識しないというのもイメージできるが、 これは「自分の実験系で出た結果は絶対に正しくて、タンパク質が検出されなくてもしょうがない」 という凝り固まった考えの上のイメージではないだろうか？ というか、TS様、千夏様らが書いてあるコメントが 自分の実験が正しいのかどうか？と考察をする普通の感覚かと思います。 仮に， ＞クロスリンクやSDS、Sonicationなどで目的のタンパク質が変性し、またIPされる量も少ないことから、 サンプルの量を多くすれば、いいじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.2489-5 - 2010/04/30 (金) 12:33:49 - Cirno 千夏様 ありがとうございます。 SDSによる目的変性タンパクでのWBで検出はできました。 しかし、現段階では、IPしたサンプルを用いたWBにおいて検出できない状態なので、おそらくIPができていないか、Sonicationでタンパクが崩壊した（比較的長い時間超音波を当てているので）かの可能性があると思ってます。 （NativeでのIPは行っていません） 結合配列等は未知なのでDNA増幅でIPの確認はできないんです；； いずれにしても、正常にIPできたかの証明は必要で、そのまま次世代シークエンサーにかけてはいけないということですね･･･。 やはり、IPで確認できるように工夫（抗体を変えるなど）したり、他の検出系を練っていく必要がありますね。

(無題) 削除/引用 No.2489-4 - 2010/04/30 (金) 11:34:34 - 千夏 >ChIP後にWestern Blottingをするべきかどうか？ （１）transcription factorをIPしたlaneとnegative controlのlane両方でDNAの増幅が認められない場合、transcription factorのIPがうまくいっていない可能性を考えてWBする必要がある。 （２）transcription factorをIPしたlaneでしかDNAの増幅は認められなかった場合、「それは本当にtranscription factorをIPした結果なのか？」という質問に答えるためにWBをする必要がある。 >クロスリンクやSDS、Sonicationなどで目的のタンパク質が変性し、またIPされる量も少ないことから、Western Blottingでの検出は不可能だと考えています。 Nativeな状態ではIPできたけれども、上記のような理由で目的タンパク質が変性してIPできなくなる可能性はあるよねー。「IPされる量が少ない」は条件が確立できてないんだと思います。IP sampleで目的タンパク質の検出が不可能な場合、その目的タンパク質をIPする必要がある実験系すべて実験として成立しないから、検出が可能な系をまず確立するべきだと思うんだけど、聞きたいこととずれてるかな？？

(無題) 削除/引用 No.2489-3 - 2010/04/30 (金) 11:13:38 - Cirno TS様 ご返答ありがとうございます。 すみません、言葉が足りませんでした；； ChIP後にWestern Blottingをするべきかどうか？を聞きたかったんです。 >変性条件でもIPできますし、IPすれば、もちろんWBできます。 そうですか。WBで出ないのはどこかがおかしいだけなんですね･･。

(無題) 削除/引用 No.2489-2 - 2010/04/30 (金) 11:02:25 - TS >私としては、クロスリンクやSDS、Sonicationなどで目的のタンパク質が変性し、またIPされる量も少ないことから、Western Blottingでの検出は不可能だと考えています。 みなさんできていますが、どういう意味でしょうか？ 変性条件でもIPできますし、IPすれば、もちろんWBできます。 >皆様はどうお考えでしょうか? >RT-PCRによる確認はできないものとします。 RT-PCRの確認とはどういうことですか？　CHIPしたときのサンプルでRT-PCRするのですか？　それとも発現量を見ると言うことですか？ いずれにしても、よくわかりません。 ちゃんと目的転写因子がIPできているかは、必要なデータですよ。 他のものも間違って落ちてきてしまっているかも、とかの検証ももちろん重要ですが。 なにか根本的な勘違いあるように見受けられますが、大丈夫でしょうか？

ChIP後のWestern Blottingの必要性 削除/引用 No.2489-1 - 2010/04/30 (金) 10:51:40 - Cirno お世話になっております。 今回はChIP（クロマチン免疫沈降）後に正しくIPされているかを確認するため、Western Blottingを行う必要があるか？ないか？についてお聞きしたいと思います。 私としては、クロスリンクやSDS、Sonicationなどで目的のタンパク質が変性し、またIPされる量も少ないことから、Western Blottingでの検出は不可能だと考えています。 皆様はどうお考えでしょうか? RT-PCRによる確認はできないものとします。

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