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ありがとうございます 削除/引用 No.2477-4 - 2010/04/28 (水) 23:23:49 - TMVG 2枚に流す方法を実践していらっしゃる方もいるようですね。 中年様と同様の経験は私もあります。リン酸化検出抗体をリプローブするとき、抗体が多く結合しているバンドでは抗原へのダメージも大きいのではないかと推測しています。確かに、定量を要する時はちょっと嫌な感じです。 コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2477-3 - 2010/04/28 (水) 10:27:52 - 中年 リプローブすると、一度目のリン酸化特異抗体によるウエスタンで強いシグナルが出たバンドが、二度目のウエスタンで不釣り合いにシグナルが弱くなったことが何度かあります。２つの抗体のエピトープが重なっている訳でもないのに、一度目の抗体がどうやって二度目の抗体との反応を邪魔しているのか不明なのですが、リプローブにはそういうアーティファクトもあり得るので、デリケートな実験ではむしろ別に流します。

(無題) 削除/引用 No.2477-2 - 2010/04/28 (水) 09:10:33 - TS ご自身でお答えを持っているような気がしますが。 それなりにケースバイケースではないでしょうか？ たしかに同一メンブレンでやらなければだめだ、と言う人もいると思います。 私も基本的には、それが好きです。 でも例えば、抗体作成種（ホスト）がリン酸化とトータルが同じであったとき、 前の抗体が少し残ってないか、とか少し気になったりして、 もう一回流して確認したりもします。 Lysateが少ないときは、このような選択肢はなくなると思います。 早く結果が知りたければ、２枚に流す方が良いですし。

リプローブするべきなのか？ 削除/引用 No.2477-1 - 2010/04/28 (水) 08:11:27 - TMVG 　よろしくお願いします。ある蛋白(X)の活性をリン酸化レベルで調べています。 　ウェスタンブロット（ECL使用）でリン酸化Xと総Xをチェックしています。1次抗体の由来種が同じなので、まずリン酸化Xを検出した後、リプローブして総Xを同一メンブレンで検出しています。 　こんな時、同量のサンプルを2枚のゲルでSDS-PAGEし、一方のメンブレンでリン酸化X、もう一方で総Xを検出する方法もあると思います。 　同一メンブレン上で評価するということの意義も理解できますが、protein lysateが十分にある時は後者の方が早く結果が分かり、リプローブによるmanipulationも加えずに済むと思います。このような時、皆様はどうされていますか？ 　変な質問ではありますが、ご意見を頂戴できればありがたいです。よろしくお願いします。

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