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核タンパク質のウェスタンブロットについて トピック削除
No.2457-TOPIC - 2010/04/24 (土) 00:50:31 - あるまじろ
現在、細胞をサイトカインで刺激し、c-Junの活性を見ています。

結果からいいますと、c-Junのシグナルは出るが、phosho-c-Junのシグナルは検出されません。

現在、細胞をRIPA Bufferで処理し、whole cell lysateでサンプルを作っているのですが、whole cell lysateではphospho-c-Junのシグナルは検出できないのでしょうか。

論文を調べてみると、hypotonic buffer　と high-salt bufferで処理し、
nuclear extract と cytoplasmic extract　を分けて、nuclear extractでウェスタンブロットしているものが多いようです。

なぜRIPA buffer ではシグナルが出ないのでしょうか。
sonicationも行っているので、核は破壊できていると思うのですが・・・

よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2457-6 - 2010/04/27 (火) 05:07:12 - ああああ
> Bradford法はSDSの影響を受けると聞いたことがあるのですが、
> それは本当ですか。

本当ですが、SDSの濃度次第です。


> 脱リン酸化阻害剤は入っていませんでした。
> p-IkBは検出できているのですが、やはり、入れるべきでしょうか。
> SDS-sample buffer やTCA固定後、細胞を溶解した場合、proteaseと同様にphosphataseも不活性化されるのでしょうか。

サンプリングしてすぐに使うのであれば、phosphataseの影響は無視できるでしょう。

> positive contorolとはどのようなものなのでしょうか。
> 実験初心者なのでいまいちどういう意味かわかりません。

本気で言っていますか？
誰か身近に相談できる人はいないんですか？
実際に手を動かす前に、もう一度、しっかり実験計画を立てた方がいいと思います。

(無題) 削除/引用
No.2457-5 - 2010/04/27 (火) 01:19:14 - あるまじろ
皆様ご回答ありがとうございます。



SDS-sample buffer で核膜も破壊する、ということについてなんですが、
細胞溶解後、Bradford法によりタンパク量を測定したいと思っています。
Bradford法はSDSの影響を受けると聞いたことがあるのですが、
それは本当ですか。
あるプロトコールでは2%SDS-sample bufferで細胞を溶解後、Bradford法により、タンパクを定量して、その後、ブロモフェノールブルーを入れています。
この方法だと、定量は可能なのでしょうか。


脱リン酸化阻害剤は入っていませんでした。
p-IkBは検出できているのですが、やはり、入れるべきでしょうか。
SDS-sample buffer やTCA固定後、細胞を溶解した場合、proteaseと同様にphosphataseも不活性化されるのでしょうか。


positive contorolとはどのようなものなのでしょうか。
実験初心者なのでいまいちどういう意味かわかりません。

よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.2457-4 - 2010/04/24 (土) 12:56:07 - NaF
ふと思ったのですが、
使っているRIPA bufferには、通常のプロテアーゼ阻害剤に加えて
脱リン酸化阻害剤（NaF, Na3VO4など）は入ってますか？

あとは、ち さんも言われているように、
positive controlのサンプルでは、どうなのでしょう？

(無題) 削除/引用
No.2457-3 - 2010/04/24 (土) 12:36:48 - ち
SDS-sample bufferで核膜も壊してしまえば？

それとも細胞質と核内タンパク質を分けたもので行わなければならない実験なんでしょうか？

それとpositive controlの刺激でリン酸化は出ているんですよね？

(無題) 削除/引用
No.2457-2 - 2010/04/24 (土) 08:17:56 - ああああ
phospho-c-Junは核に移行しますよね。
nuclear extract中にはphospho-c-Junは濃縮されてるっていう言い方は良くないかもしれませんが、nuclear extract中に占める存在量は多いです。

しかし、nuclear extractはcytoplasmic extractと比較するとタンパク質量は多くても1/10ぐらいです。
なので、whole cell lysateではnuclear extractと比較するとphospho-c-Junが1/10くらいに薄まってしまいます。

どうしても、whole cell lysateで検出したいのであれば、流すタンパク質量を増やすか、長めにexposeするか、anti-c-jun抗体でIPしてphospho-c-Junを検出すればいいんじゃないですか？
まぁ、分画した方がいいと思いますが･･･

核タンパク質のウェスタンブロットについて 削除/引用
No.2457-1 - 2010/04/24 (土) 00:50:31 - あるまじろ
現在、細胞をサイトカインで刺激し、c-Junの活性を見ています。

結果からいいますと、c-Junのシグナルは出るが、phosho-c-Junのシグナルは検出されません。

現在、細胞をRIPA Bufferで処理し、whole cell lysateでサンプルを作っているのですが、whole cell lysateではphospho-c-Junのシグナルは検出できないのでしょうか。

論文を調べてみると、hypotonic buffer　と high-salt bufferで処理し、
nuclear extract と cytoplasmic extract　を分けて、nuclear extractでウェスタンブロットしているものが多いようです。

なぜRIPA buffer ではシグナルが出ないのでしょうか。
sonicationも行っているので、核は破壊できていると思うのですが・・・

よろしくお願いします。
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