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(無題) 削除/引用 No.2456-12 - 2010/04/26 (月) 11:28:15 - 田舎もの ザンギさま コメントありがとうございます。 ネオマイシンとG418の違いなど、不確実な知識の中で実験を進めてしまいました。ザンギさんのおっしゃる通り、ネオマイシンでやってみたいと思います。 また、不明な点がございましたら、質問させてください。

(無題) 削除/引用 No.2456-11 - 2010/04/25 (日) 23:39:31 - ザンギ 抗生物質は似たような構造でも抗菌スペクトルが違うし有効な濃度も違います。 質問の件では特別な理由がなければメーカー推奨のネオマイシンを使うべきです。

(無題) 削除/引用 No.2456-10 - 2010/04/25 (日) 08:37:23 - 田舎もの ザンギさま 言葉が少なくて申し訳ありません。現在タカラバイオのBrevibacillus発現システムを用いて、あるタンパク室を発現・分泌させようと思っています。 ベクターはやはり同じタカラバイオのpNC-HisTです。このベクターにネオマイシ耐性遺伝子が入っていて、当初G418でセレクションしていたのですが、タンパク発現が確認できません。 ベクターコンストラクトが間違っている、ベクターの精製度が悪い、あるいはトランスフォーメーション(エレクトロポレーション)に失敗しているかも、と思い、空ベクター(大元のチューブから使用)や遺伝子を入れずにプレートに蒔いてみました。 すると、プロトコル推奨の10ug/mlのG418(実際のプロトコルではネオマイシンですが)では、遺伝子(−)でも他と同じ数のコロニーができてしまいました。 そこで疑問が生じたわけです。 G418でﾌﾞﾚﾋﾞﾊﾞﾁﾙｽのセレクションは可能なのか？(遺伝子が入らない菌はちゃんとG418で死んで、pNCが導入された菌はG418に耐性となるのか) ※いくつか、調べてみるとG418は70sにも作用はするようなのですが、実際やってみたらうまくいかなかった、ということです。 あるいはこの系ではG418が使えずにネオマイシンでなければならないのか？ …と、いうのが事の経緯です。 一応、次回はネオマイシンを購入して、いくつか、ネオマイシンの濃度を振って挑戦してみる予定です。 ベクター配列については、これから確認してみます。 ご意見お待ちしております。

(無題) 削除/引用 No.2456-9 - 2010/04/24 (土) 22:13:55 - ザンギ 質問者の方が原核細胞とか原核生物と表現していらっしゃるので、話題にあがって いる抗生物質が薬剤耐性遺伝子を利用した選抜に有効かどうかの判断ができません。 全ての原核生物を殺したり生育抑制したりできる抗生物質が存在するかどうか 知りません。G-418は医療分野で使われないので、作用スペクトルはあまり調べ られてないんではないでしょうか。 大腸菌が対象なら話は簡単です。 Tn5由来のネオマイシン耐性遺伝子を導入した大腸菌ならカナマイシンで選抜 出来ます。ほとんどの分子生物学系の研究室ではそうしてるはずです。

初めの質問の回答は 削除/引用 No.2456-8 - 2010/04/24 (土) 15:43:34 - ~ Cancer Res. 2009 Jul 15;69(14):5970-7. Epub 2009 Jun 30. microRNA miR-196a-2 and breast cancer: a genetic and epigenetic association study and functional analysis. ライセンスが無いので、内容を確認できませんが、 形質転換したDH5aをG418入りのLBプレートでセレクションしているようです。 ただ、うちのラボで、特別な理由も無くカナマイシンではなくG418を使ったら、 無駄遣いだと怒られます。

(無題) 削除/引用 No.2456-7 - 2010/04/24 (土) 15:29:15 - ~ >ネオマイシン耐性と表記されたベクターを導入した原核生物はカナマイシンでもセレクトできる １．使用しているネオマイシン耐性の遺伝子が何かを確認する ２．その遺伝子が、カナマイシン耐性としても作用するかを確認する でこの疑問についての回答が得られるでしょう。 また、メーカー品のベクターを使っているのであれば、 http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3347-5.pdf などのメーカーからの情報はもっておきましょう。 ザンギさんの書かれているTn5遺伝子をあなたが使っているのであれば、 上記のリンク先の >the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5 という表記から、あなたの求めている情報が得られます。 貴方がTn5以外のネオマイシン耐性遺伝子（あるかどうか知りませんが）を使っているのであれば、 その遺伝子の情報無しに、回答を得ることは出来ないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2456-5 - 2010/04/24 (土) 15:01:53 - 田舎もの ザンギさま それはつまり、ネオマイシン耐性と表記されたベクターを導入した原核生物はカナマイシンでもセレクトできる、ということですか？素人質問ですいません。

(無題) 削除/引用 No.2456-4 - 2010/04/23 (金) 21:42:35 - ザンギ ネオマイシン耐性遺伝子は原核生物のトランスポゾンTn5から単離されたものと 記憶しています。なのでネオマイシン耐性の原核生物は存在するはずです。 この耐性遺伝子を導入した原核生物の選抜には、普通はG-418やゲンタマイシン やネオマイシンは使わないで、カナマイシンを使います。 実験室レベルであまり使われないのは、おそらくコストが理由でしょう。

(無題) 削除/引用 No.2456-3 - 2010/04/23 (金) 20:48:24 - 田舎もの ggrさま 提示いただいたトピは、あくまでネオマイシン(G418ではなく)が真核細胞のセレクションに使えるか、という内容だと理解しております。 私はその逆と申しますか、薬理作用として『70Sと80Sの両方に効果がある』とも言われているG418の作用に対して、原核細胞タンパク発現用ベクターのネオマイシン耐性では抵抗性が出せないのか、という点に疑問を持っております。 つまりネオマイシン耐性の原核細胞タンパク発現用ベクターを原核細胞に導入した場合、G418含有のプレートではセレクションかけられないのか、ということです。 わかりにくい説明で申し訳ありませんがよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2456-2 - 2010/04/23 (金) 20:12:50 - ｇｇｒ 過去のトピに同様のものがあります http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=435

G418と原核細胞 削除/引用 No.2456-1 - 2010/04/23 (金) 19:52:01 - 田舎もの ネオマイシン耐性の原核細胞発現用のベクターを導入した場合、 セレクションはG418（ジェネティシン)の使用は不可能なのでしょうか？ 両者が別物だという理解はあります。 G418は両方に効くようなので、 原核細胞でセレクションする場合にはどうなのか、と疑問に思った次第です。 最近、原核細胞でネオマイシン耐性という例が無いので、 お分かりになる方よろしくお願いします。

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