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(無題) 削除/引用 No.2455-15 - 2010/05/06 (木) 08:20:49 - Mizuki masaさん 参考になります。 知識がなく、多くの論文を読んでみましたが 細胞はアポトーシスできるようです。 masaさんのコメントで ｢あくまでも細胞がアポトーシスに移行するための準備段階の反応ですのでより早期でも検出できると思います。ＤＮＡの断片化や、PARPの断片化を観察するのであれば、浮いている細胞ごと回収したほうがいいと思います。｣ とても参考になります。 細胞回収時間をはやめてもう一度実験系を組みなおしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2455-14 - 2010/04/28 (水) 21:03:03 - masa 使用されている細胞株は血清飢餓によるアポトーシス誘導についての報告が無いのでしょうか？ 個人的な意見ですが栄養枯渇のような生体で起こりうる環境変化に対しては正常細胞の殆どがアポトーシスによる自己処理を行うような印象があります。p53もATP濃度のセンサーであるAMPKによってリン酸化され、活性化されたと記憶しています。 Mizuki 様が観察されようとしているアポトーシスのいくつかの項目についてはそれぞれ観察に最適なタイムコースを個別に設定したほうがいいように感じます。 細胞の大部分が浮いて死滅しているところまでいくと遺伝子の発現変動を評価するのには時間が遅い気がします。あくまでも細胞がアポトーシスに移行するための準備段階の反応ですのでより早期でも検出できると思います。 ＤＮＡの断片化や、PARPの断片化を観察するのであれば、浮いている細胞ごと回収したほうがいいと思います。 血清飢餓においてG0期に移行できない所を見ると癌細胞を使用されているのでしょうか？癌細胞によっては遺伝子の変異によってp53やカスパーゼが不活化している場合もありますので特定のアポトーシス評価系が使いにくい可能性が考えられますので一度文献を当たってみてはいかがでしょうか？ 長文失礼致しました。

(無題) 削除/引用 No.2455-13 - 2010/04/26 (月) 09:23:28 - Mizuki Oさん PARP P53　ATM/ATRのことは考えていませんでした。これも調べることにします。ATM/ATRあたりはウェスタンじゃないとだめでしたよね？ うさん 私は質問者としてもっとコメントしていただいた方々のアドバイスに対して答えを見出すべきでした。 ＞着目するもなにも、70の細胞が死んでいる時点で、遺伝子の発現を見るというのはサンプリングする時間として遅いということです。 確かにそうですね･･･

(無題) 削除/引用 No.2455-12 - 2010/04/25 (日) 14:16:20 - う ＞１００あった細胞のうち７０の細胞が死んで浮いた時、残りの３０でけに着目のもどうなのでしょうか。。。 私が言いたかったことが伝わっていません。 問題は、 アポトーシスなりなんなり、死んだ細胞がいるとして、 「死を完了してしまった細胞」を集めて、いろんな遺伝子の発現を調べて 発現が減ったとか言ってなんの意味があるのか？ ということです。 ＞１００あった細胞のうち７０の細胞が死んで浮いた時、残りの３０でけに着目のもどうなのでしょうか。。。 着目するもなにも、70の細胞が死んでいる時点で、遺伝子の発現を見るというのは サンプリングする時間として遅いということです。 Caspaseさんの書き込みが非常によく考察されたものだと思います。 質問者様はその書き込みをもっと深く受け止め無ければならないと思います。 受け止めているのであれば、上記のような書き濃いは無いと思いますが。 ＞しかし、細胞同士で見るとバラついていますが、同じような条件で他の各サンプルでも細胞同士でバラついているはずで、各サンプルの平均値で見てそれぞれ比較できるのではないかと考えるのですが、どう思いますか？ どういうことをしようとしているのか、もう一度考えた方がいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2455-11 - 2010/04/25 (日) 11:56:48 - o PARP P53 ATR/ATM をチェックしていましたか？

みなさん、ほんとにありがと♪ 削除/引用 No.2455-10 - 2010/04/25 (日) 10:21:12 - Mizuki 沢山のコメントありがとうございます。 うさんのご指摘どおり、浮いている細胞はいろんな段階の細胞でそれらを回収して解析することはナンセンスであると私も考えてました。。。 しかし、１００あった細胞のうち７０の細胞が死んで浮いた時、残りの３０でけに着目のもどうなのでしょうか。。。 TSさん 今回の細胞ではBax,Bcl-2 がアポトーシスによって発現変動することが報告されています。しかし、Annexin Vキットとか用いるなり、着目する対象の幅を広げるのもありですよね。 Oさん 今回用いている細胞はPC12細胞です。神経保護作用解析のために血清飢餓培養で系を確立しようと試みているのですがうまくいかず。。。たしかに、いくつかの論文を見てみると血清飢餓培養によるBcl-2の発現変動は微妙な結果でした。 vwxyzさん ご指摘の通り、Autophagic Cell Deathの可能性があります。ネクローシスの可能性もあります。だからすごい困っています。どこから解析したらよいのか。今はDNA ladderの確認を行っていこうと考えています。 Caspaseさん たしかに全ての細胞が同じようなタイムコースでシグナルが働いているかを考えていませんでした。サイトカイン等に比べて血清飢餓による刺激は緩やかに働きそうですので、細胞の個体差が大きく出そうですよね。 しかし、細胞同士で見るとバラついていますが、同じような条件で他の各サンプルでも細胞同士でバラついているはずで、各サンプルの平均値で見てそれぞれ比較できるのではないかと考えるのですが、どう思いますか？分かりにくい説明で申し訳ありません。。 でもご指摘されたとおり、ある時点における形態変化を同じように起こしているか調べてみるところから行わないとです。すごい参考になります。

(無題) 削除/引用 No.2455-9 - 2010/04/24 (土) 14:10:34 - Caspase 血清飢餓条件での細胞死は携わったことがありませんが、その他の刺激による細胞死の解析を行っています。 ひとつの細胞が血清飢餓から死に至るまでには様々なプロセスを経ていくことはご存知かと思いますが、浮いている細胞を解析に加えるのか否か、については観察する指標がどのステップであるのか、に依存すると思います。見たい指標が細胞が浮くという現象より前のステップであれば、加えないほうが良いでしょうし、後であれば加えたほうが良いでしょう。 また、浮いていない細胞がこれらのステップが動いていない、浮いている細胞は動いていると考えるのはやや乱暴に思います。実際は、浮いていない細胞はシグナルが動いているけれども、浮く段階にまでは至っていないというものが大多数でしょう。 もう一点、これは私の興味でもあるのですが、サイトカイン等に比べて血清飢餓による刺激は緩やかに働きそうですので、細胞の個体差が大きく出そうに思いますがいかがでしょうか？ その観点で注目すべき点は、ディシュ内の大多数(80%以上)の細胞が等しく同じタイムコースでシグナルが動いているのかどうかが気になります。 ディシュ内の細胞の大多数が、ある時点における形態変化（あるいはAnnexin-VやTunnel、PI陽性など)を同じように起こしていますか？そうではないようであれば、ディシュ内の細胞は刺激後、てんでバラバラにシグナルを動かしていると考えられるので、クリアーな結果を得ることは難しいのではないかと思います。たとえば単クローン化する、あるいは高感受性な細胞を使うなどの一手間が必要なように思いますがいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2455-8 - 2010/04/23 (金) 23:25:34 - o vwxyz 様　　ありがとうございました 勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.2455-7 - 2010/04/23 (金) 23:09:55 - vwxyz 血清飢餓状態になると一般的にはAutophagyが誘導されるといわれていますよね。 もしかしたらAutophagic Cell Deathが関わっていたりするかも？ 専門外の横レスで申し訳ないです。

(無題) 削除/引用 No.2455-5 - 2010/04/23 (金) 21:51:44 - o どんな細胞を使っているですか？ 付着細胞はうっていることになったら、細胞は一体死にたか、アポトーシスしたか、いえないです。 細胞を刺激する前に、いつも飢餓培地に交換する。 私はアポトーシスの研究をやった経験がありますが、BCL-2を測定するのはpositive結果を出にくい気がありました。他の因子をチェックして、すごく良い結果なのに、BCL-2の結果はいつもうまくいかない。 だから、他のアポトーシス関する因子をチェックしてければ、多分良い結果でると思います

(無題) 削除/引用 No.2455-4 - 2010/04/23 (金) 19:20:43 - TS 浮いている細胞は、やっぱり調べてもダメだと思います。わたしも、うさんに同意です。 専門家ではないですが、BaxとBcl-2の発現量増加は、すべてのアポトーシスで起きるのですか？ AnnexinVとかもアポトーシス判定にかなり広く使われると思いますが、BaxとBcl-2だけでは、アポトーシスの証拠を拾い損ねてるのではないでしょうか？ それと、ワンポイントの経過時間ではなく、経時的なサンプリングをしたほうが良いと思います。（してたらすみません）

(無題) 削除/引用 No.2455-3 - 2010/04/23 (金) 18:34:27 - ち うさんに激しく同意

(無題) 削除/引用 No.2455-2 - 2010/04/23 (金) 18:05:09 - う 私は飢餓にしたときに起こる細胞死がアポトーシスなのか？ 一体何がアポトーシスなのか、時々わからなくなるのですが、 １つだけ言えると思うのは、 浮いている細胞は、何で死んだにせよ、いろいろな段階じゃないでしょうか？ それこそ、死んでかなりたって何やらよくわからない残りカスや、今まさに浮いてきた細胞などなど。 個人的には、 それを集めてきて、ある遺伝子の発現が減少しているとかどうとか言って 何の意味があるのでしょうって思います。 個人的な思いはさておき、 いくら細胞株といっても、飢餓のような誘導の仕方では １つ１つの細胞によってレスポンスはちょっとずつ違うと思うので、 経時的にサンプリングして死んでいる細胞に起こっている現象を見るということは かなり難しいことだと私は感じます。

アポトーシス誘導できない(ToT)・・・・ 削除/引用 No.2455-1 - 2010/04/23 (金) 17:14:48 - Mizuki いつもこの掲示板には大変お世話になっています。 では、質問をさせていただきます。 ある付着細胞を血清飢餓培養(12hr、24hr、48hr)し、アポトーシス誘導を行いました。上清除去後(浮いている細胞も除去)、細胞回収し、Bax、Bcl-2の発現量を調べたところ血清飢餓培養を行っても全く変化無しでした。。。 血清飢餓培養を行い、経時的に生細胞数も減少していることを確かめたのですがネクローシスかもしれません。。。 まずアポトーシスが起こっているのか、DNALadderを確かめるなりしなきゃなのですが、ここで質問です。 血清飢餓培養を行い、上清除去後をした際に浮いている細胞も除去したのはOKなのでしょうか？ 浮いている細胞にこそ、アポトーシスが起きている細胞であり、解析する対象となるのではないかと考えたのですが。。。 どうなのでしょうか？ 初心者なので、初歩的な質問で申し訳ないのですが宜しくお願いいたします。

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