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(無題) 削除/引用 No.2450-3 - 2010/04/27 (火) 12:13:34 - パンタ 一度、GFP mRNAをインジェクションしてみてはいかがでしょうか？ 私の経験を申し上げますと、ToyoboのT7 polを使用して約7kbのmRNA合成をしたことがあります。その時はプラスミドの精製度に特に気を遣いました。もちろんうさんの仰るように、電気泳動での確認は必須です。

(無題) 削除/引用 No.2450-2 - 2010/04/23 (金) 16:23:08 - う ＞比較的長い遺伝子ではありますが、プロトコールをみた限りでは合成範囲内だと書いてあるので、長さによる問題でもないと考えております。 さぁ〜それはどうでしょうか？プロコトールを鵜呑みにし過ぎでは？ 少なくとも電気泳動して（もちろんRNA用の） 大きさがちゃんとしているかくらい確認したほうがいいのでは？

in vitro mRNA合成 削除/引用 No.2450-1 - 2010/04/23 (金) 12:18:51 - NS 今現在、ある目的遺伝子（４kb）のmRNAをin vitro（mMassage mMACHINEキット)で合成し、そのmRNAをゼブラフィッシュ胚にインジェクションをして目的タンパク質を過剰に発現させようとしています。ベクターはpCS3+MTを使用しており、ベクターをNotlでリニアーにして、SP6プロモーターを利用してmRNA を作成しています。作成したmRNAをインジェクションし、９時間後、胚をホモジェナイズして、抗Myc抗体でウェスタンにより検出しました。しかし、まったくと言ってよいほど目的タンパク質が検出できませんし、表現型も出ません。この実験の前に、培養細胞にて作成したプラスミドから過剰発現によるタンパク質の検出はできています。in vitro合成のコントロールとして、GFPのmRNAを作成していますが、こちらは上手く発現してくれるので、合成の段階によるトラブルではなさそうです。また他に、SP6をT7プロモーターに変えても結果は同じでした。比較的長い遺伝子ではありますが、プロトコールをみた限りでは合成範囲内だと書いてあるので、長さによる問題でもないと考えております。 そこで、どなたかうまく発現しないときの対処法をご存知の方はご教授お願い申し上げます。はっきり言って、もうお手上げ状態です。

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