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(無題) 削除/引用 No.2446-6 - 2010/04/24 (土) 22:50:05 - o phosho-c-Junが出る早いじゃないですか 10分ない

(無題) 削除/引用 No.2446-5 - 2010/04/24 (土) 00:49:46 - あるまじろ 申し訳ございません。 新しいトピックを作るつもりがメッセージを投稿してしまいました。

核タンパク質のウェスタンブロットについて 削除/引用 No.2446-4 - 2010/04/24 (土) 00:47:22 - あるまじろ 現在、細胞をサイトカインで刺激し、c-Junの活性を見ています。 結果からいいますと、c-Junのシグナルは出るが、phosho-c-Junのシグナルは検出されません。 現在、細胞をRIPA Bufferで処理し、whole cell lysateでサンプルを作っているのですが、whole cell lysateではphospho-c-Junのシグナルは検出できないのでしょうか。 論文を調べてみると、hypotonic buffer　と high-salt bufferで処理し、 nuclear extract と cytoplasmic extract　を分けて、nuclear extractでウェスタンブロットしているものが多いようです。 なぜRIPA buffer ではシグナルが出ないのでしょうか。 sonicationも行っているので、核は破壊できていると思うのですが・・・ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2446-3 - 2010/04/22 (木) 16:56:18 - まと 早速のレスポンスありがとうございます。遺伝子導入していない細胞はウエスタンをかけていません。すぐに遺伝子導入していない細胞も一緒にウエスタンかけてみます。

(無題) 削除/引用 No.2446-2 - 2010/04/22 (木) 16:48:21 - ち 遺伝子を導入した細胞としていない細胞とでそのbandの出方に違いはありますか？

ウエスタンブロット 削除/引用 No.2446-1 - 2010/04/22 (木) 16:35:19 - まと はじめまして。ウエスタン初心者です。マウスの線維芽細胞株にある遺伝子をエレクトロポレーションにて導入し、48時間後に蛋白質を抽出して、その発現をウエスタンブロットで確認する実験を行いました。抗体の添付文書によるとその遺伝子の発現が見られるときには120KDaにバンドがみられるとのことですが、数回ウエスタンブロットを行っても120KDaにはバンドは見られず、毎回それよりも下の25KDaに強いバンドが見られます。これは非特異的なバンドでしょうか？または分解産物を見ている可能性が高いのでしょうか？抗体がワークしていないのでしょうか？同じような経験をされた方で何か思い当たることがありましたら教えていただければ幸いです。誠にお手数でありますがどうぞよろしくお願いいたします。

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