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ついでながら 削除/引用 No.2439-12 - 2010/04/24 (土) 00:25:01 - ちょこ oligo-d(T)にVNがついているプライマーは、VNがついてないプライマーよりも、rRNAに張り付きやすい筈です。

(無題) 削除/引用 No.2439-11 - 2010/04/23 (金) 09:35:29 - ザンギ トータルRNAを鋳型にした場合に混入してくるrRNAの配列は限定されてますから、 その配列を特定してcDNAライブラリーをサブトラクションすればいいんじゃない でしょうか。 サブトラクションに市販の前述のrRNA除去キットも使えるかもしれませんが、 配列が有効じゃない気がします。 今ほどシーケンサーのスループットがなかった時代には、cDNAのサブトラク ションやノーマライズが有効とされていました。rRNA除去キットはLNAを利用 したRNAのサブトラクションとも言えますね。 最近の技術についてフォローしてなかったので、このスレッドは勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.2439-10 - 2010/04/23 (金) 00:36:17 - ちょこ "情報"でなくて思いつきを書いたもので、元ネタや実績があるわけではありません。すみません。 長めのoligo-dTを用いて高い温度でRTしたらribosomal RNAが排除できるのではないかという思いつきで、oligo-dTのTmを計算してみました。すると、30merでもTmが思ったほど高くなかったので、40merで書いてみました。40merが実際によいかどうか、実験的な裏付けはありません。 耐熱性の逆転写酵素は、探せば幾つかあると思います。とりあえず、今ぱっと探してみて見つかったものを挙げておきます。 http://www.invitrogen.jp/catalogue/invitrogen/11150-025_001.shtml http://www.neb.com/nebecomm/products_Intl/productE6550.asp 効率が良いかどうかわかりませんが、Tthも高い温度でいけますよね。

(無題) 削除/引用 No.2439-9 - 2010/04/22 (木) 20:12:29 - きっと どこの会社か忘れましたが、rRNAを増やしにくい逆転写用のプライマーが売られてたと思います。 問題はランダムプライマーだということなんですが。

(無題) 削除/引用 No.2439-8 - 2010/04/22 (木) 13:18:56 - Real-time ちょこ様 ご情報をくださりありがとうございます。 oligo-(dT)40はRTで使われることが多いのでしょうか？私はoligo-(dT)20とSuperScriptIII(SSIII)しか使ったことがなく、参考にしようとした文献ではoligo-(dT)24+アダプタープライマーを逆転写で使っているので、oligo-(dT)40を使っての実験は思いつきませんでした。耐熱性逆転写酵素とはSSIII（通常50度で使用）より高熱に耐性がある酵素という意味でしょうか？ その他の条件なども知りたいので文献などで使っている例を教えていただければ幸いです。

rRNA　プライマー 削除/引用 No.2439-7 - 2010/04/22 (木) 12:19:18 - Real-time >rRNAのPCR primerをプライマーバンクで探してみることにします。 ABIで使われていた18Sの配列の番号で検索してみましたが、見つかりませんでした。一応primer blastをかけて探している最中ですが、文献やキットなどヒトrRNAプライマーの情報をお持ちの方いましたらお教えください。

思いつきですが 削除/引用 No.2439-6 - 2010/04/22 (木) 12:06:49 - ちょこ oligo-(dT)40とRNAを混ぜて、 65度5分→55度1分→バッファー等添加後2分→耐熱性逆転写酵素添加 こんな感じでRTをしたらrRNAが逆転写される量をかなり減らせたりはしないでしょうか。 28S rRNAと18S rRNAの配列を見ながらそんなことを考えてみました。

(無題) 削除/引用 No.2439-5 - 2010/04/22 (木) 11:40:20 - Real-time きっと様 ありがとうございます。私も講習会でAffymetrixのchipを使う際IVTの2回がけを行ったことがあります。一細胞からのライブラリ作成の論文ではPCRで増やしていましたが、IVTの方がバイアスがかかりにくいと聞いています。しかし何分Total RNAで10ngしかないのでIVTの適用外になるのではと心配です。ちなみにインビトロジェンのrRNAを除くキットは最低2ugのRNAが必要となっています。 精製せずにpolyTで逆転写＆T7プロモータを含んだプライマーでRT-PCRし、IVTでRNAを増やしてからｒRNAを除くキットを使って精製することってできるのでしょうか？途中までは一細胞からのマイクロアレイのプロトコール（Nature Protocols 2007 Vol.2 No.3)が役に立ちそうですが、INVITROGENのキットがこの方法でも動くかは疑問です。LNAで吸着されるはずの配列がせん断され、rRNA除去効率はたぶん低下するでしょう。しかし最初の段階でカラムへの非特異吸着でRNAを失ってしまうのも怖いのです。 ともかく各ステップでのrRNAの残留を確かめるため、rRNAのPCR primerをプライマーバンクで探してみることにします。 このテーマでご意見を下さる方、引き続きご歓迎いたします。

(無題) 削除/引用 No.2439-4 - 2010/04/22 (木) 10:30:52 - きっと インビトロジェンのrRNAを除くキットを使った事がありますが、 rRNAが結構残る（電気泳動で確認出来るぐらい激減しますが、やはり大部分がrRNA） mRNAの分解が進む というデメリットがありました。 キットでrRNAを減らして、オリゴdTプライマー+T7プロモーターで逆転写して IVTでmRNAを増やす　 ぐらいやれば大部分がmRNA由来のRNAライブラリーを作成出来ると思います。（アフィメトリクスのChipに少量RNAを掛ける時の方法）

(無題) 削除/引用 No.2439-3 - 2010/04/22 (木) 05:43:22 - Real-time ザンキ様、教えていただきありがとうございます。 ＞rRNAの配列中にAのオリゴマーが存在する そのお話を聞くと、Dyna beadsのpoly-Tを用いたキットを用いた後に、polyTで逆転写するよりは、INVITROGENのrRNA除去キットを用いた後にpolyTの逆転写を行うと効果がありそうな印象を受けました。もちろん収率や回収産物の純度もあるので一概には言えませんが。どなたかこれらのrRNA除去キットを使った方のご経験も聞かせて頂きたく思っています。よろしくお願いします。 rRNAの検出はprimer bankからrRNAのプライマーを探して、real-Time PCRで課ハウスキーピング遺伝子と量的に比べることで行うつもりです。agilentは依然使おうとしましたが、私達のRNAでは必要量に達しませんでした。他に良い方法をご存知の方いましたらお教えください。

(無題) 削除/引用 No.2439-2 - 2010/04/21 (水) 17:40:34 - ザンギ >polyTプライマーを使った逆転写反応とpolyA RNA抽出キット又はrRNA除去キットではどちらが、rRNAの除去に効率的なのでしょうか？ トータルRNAを鋳型にしてオリゴdTプライマーで逆転写したときは、8割くらいは rRNAでした。 rRNAの配列中にAのオリゴマーが存在するため、オリゴdTプライマーだけでは 特異性が不十分なようです。 5倍のクローンをとれればポリA精製は必要ないのかもしれませんが、発現レベル の低い遺伝子のmRNAは逆転写されにくくなるのかもしれませんね。

ごく微量サンプルからのrRNAの除去 削除/引用 No.2439-1 - 2010/04/21 (水) 08:47:31 - Real-time 2010年のNature ProtocolVol.5No.3p516-を参考にごく少量のRNAから、NextGeneration sequencer用のcDNAライブラリを作ろうと思っています。このプロトコールは2009年のNature Method Vol6 No5 p377-と同じ著者なので、大まかな流れと細かなプロトコールが理解でき大変ありがたかったです。後者はABIのApplication noteにも引用されているため、ABIの公認と思っていました。 しかし、ABIに聞くと100ng以上のrRNAを除外したRNA又はpolyAカラムをかけたRNAが必要と言われました。ここで疑問が生じたのですが、polyTプライマーを使った逆転写反応とpolyA RNA抽出キット又はrRNA除去キットではどちらが、rRNAの除去に効率的なのでしょうか？教えていただければ幸いです。 上記の論文では一細胞を対象にしていたためpoly-T+アダプタプライマー RTで行っていました。polyA配列のないRNAは今回対象にしないため、私もRTにはpolyT+アダプタプライマーを使うつもりです。しかし私達のサンプルは1-10ngのtotal RNAなのでpolyTカラムまたはrRNA除去キットを使うべきかどうか迷っています。 皆さんは微量サンプルからのrRNA除去はどうしていますか？ご意見お待ちしています。

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