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(無題) 削除/引用 No.2437-9 - 2010/04/22 (木) 17:22:36 - びんぼう コロニーを別のプレートに1ｃｍ2に塗り拡げる。 ↓O/N 生えた1ｃｍ2の大腸菌を50μLのTEに懸濁 ↓ 50μLのフェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール＝50/49/1 を加える。 ↓ ボルテックス ↓ 15000rpm, 10min 遠心 ↓ 空ベクターと上清10μLを電気泳動 ↓ 空ベクターより分子量が大きいものにインサートが入っている可能性がある。 ↓ ミニプレップへ

(無題) 削除/引用 No.2437-8 - 2010/04/21 (水) 11:48:57 - in situ とりあえず、羊土社などから出ている遺伝子工学のマニュアル本を一通り読むことをお勧めします。 大概の研究室には置いてありますし、なければ図書館に行けばあるはずです。 チェックの方法としては １．薬剤（アンピシリンやカナマイシン）耐性遺伝子を持つベクターを薬剤含有プレートで培養してコロニーが生えてくるか ２．ベクターに組み込まれているβgal遺伝子を利用した青白スクリーニング ３．コロニーPCR ４．ミニプレップして制限酵素処理⇒泳動チェック ５．ミニプレップしたものをシークエンス 下に行くほど確実性が上がりますが、手間とコストがかかります。 なので、上の方の方法でスクリーニングした後、ポジティブな可能性が高いクローンに関して、シークエンスで最終チェックするというのが一般的ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2437-7 - 2010/04/21 (水) 11:23:41 - etymophile 自分は質問の内容を， 「プラスミドがきちんと大腸菌に取り込まれているかどうか。」 と解釈していました。 プラスミドに遺伝子がきちんと挿入されているかどうかは， blue white screenという方法があります。 ただ最終的にはシークエンスで目的の遺伝子が 正しく挿入されているかを確認する必要があると思います。

(無題) 削除/引用 No.2437-6 - 2010/04/21 (水) 10:19:16 - Pumpkin >大腸菌に遺伝子がきちんと入っているか は、 >抗生物質を含む培地で培養すること では確認できないですよね。拾ってみて空ベクタなこともあるし、(PCR産物だとして）non specificな産物のインサートだってあるわけですから。PCR由来だったらエラーだって気にしなければいけないので「きちんと」確認するならシークエンスしかないと思います。 ベクター間の乗り換えだったらシークエンスでなくて制限酵素断片の確認でもいいかもしれません。PCRは目的DNAのコンタミも考えられるので実験デザインをよく考えた方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.2437-5 - 2010/04/21 (水) 10:09:22 - etymophile プラスミドに抗生物質耐性遺伝子が存在していれば， その抗生物質を含む培地で培養することにより形質転換の有無が確認できます。

(無題) 削除/引用 No.2437-4 - 2010/04/21 (水) 09:57:06 - Pumpkin PCR（といってもデザインは色々ある）、 制限酵素消化によるDNA断片サイズの確認、サザンブロットなど色々ありますが、やはり最終的にはシークエンスするしかないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2437-3 - 2010/04/20 (火) 23:53:56 - ~ 原子間力顕微鏡で塩基配列を読む。 きちんと入っているかの確認であれば、PCRはあまり適当ではないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2437-2 - 2010/04/20 (火) 23:26:19 - 小言幸兵衞 レポートの課題ですか？

形質転換 削除/引用 No.2437-1 - 2010/04/20 (火) 21:23:19 - あやか 今私は、プラスミドにある遺伝子を組み込みそれを大腸菌に形質転換させています。 そこで、大腸菌に遺伝子がきちんと入っているかを確認する段階なのですが、、 その確認方法としてどのような方法が挙げられますか？ 教えてください。 私が考え付くものとしましては、やはりPCRがありますが、ほかにも長所短所を持った方法はあるのでしょうか？ よろしくお願いします。

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