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(無題) 削除/引用 No.2433-3 - 2010/04/23 (金) 01:17:35 - AP なにか特別な方法を採用していない限り、3' RACEだけでなく5' RACEでも、末端配列にバリエーションをもたらすisoformが存在しなくても、たとえRACE産物がシングルバンドに見えていても、末端側がどこまで伸びているかは分子ごとにかなりばらけているはずです。5'側のどこで逆転写が止まるかはコントロールできないので。それでもgene specific primerでシークエンスすれば読めるのでdirect sequenceも可能です。同様に、シングルバンドになっていなくても3' RACE産物もgene specific primerでシークエンスすればうまくいくかもしれません。 isoformの存在が原因でない場合、3' RACE産物にバリエーションができるのは、oligo-dTプライマーがpoly-A tailのどこからプライミングするかが振れるからですが、それを防ぐためにoligo-dTの3'末端の一塩基または二塩基をT以外でdegenerateしたプライマー(N-TnまたはNN-Tn)で逆転写する方法もありますね（たとえばMarathon system)。poly A tailと最終exonの配列の継ぎ目からのみプライミングが起こるように意図されているわけです。3' RACEはgene specific primerと、oligo-dT primerの5'側に付加したprimer annealing sequenceに対するprimerで行います。oligo-dT primerでPCRをかけると、アニール位置がスリップするのでバリエーションを増幅します。

(無題) 削除/引用 No.2433-2 - 2010/04/20 (火) 13:06:30 - Pumpkin 3'-RACEはpoly A付加位置の違いによって産物が多く得られることが多く、しばしばシングルバンドとして得られないことがあります。そのためスメア状やブロードなバンドが検出されることがあります。 既知配列部分を多めにとることによって、電気泳動でシングルバンドのように見えることがありますが、クローニングすると上記のようなPoly A付加位置の違うmRNAタイプが検出されることがあります。 ですので、既知配列を長めにとって3'-RACEを行ってクローニング（TAが妥当だと思います）。続いて、制限酵素処理やsouthern blottingをするなどの確認手段を経るか、片っ端からシークエンスするのがいいと思います。RACEはただでさえ非特異的産物が増えやすい方法ですからダイレクトシークエンスでは無理があると思います（特にファミリーの場合）。 ダイレクトシークエンスだとプライマー近旁は読めないので、既知配列が短い場合には目的の遺伝子かすらわからないということになりかねません。やはりクローニングしてからの方がいいと思います。

3'RACE,5'RACEについて 削除/引用 No.2433-1 - 2010/04/20 (火) 12:20:55 - トク 私は、現在げっ歯類の動物を用いて遺伝子の同定を行っています。 今まではわかっているほ乳類の塩基配列も基にプライマーを設計し、PCR、切り出しなどを行い、 バンドが一本になったところで、ダイレクトシークエンス法で塩基配列の同定を行っていました。 しかし、その方法では3'RACEを行う時に限界があり、バンドを一本にすることが出来ません。 今考えているのはTAクローニングですが、他の方法だとどんな方法が考えられますか？ 教えてください。よろしくお願いします。

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