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(無題) 削除/引用 No.2428-13 - 2010/04/22 (木) 21:09:31 - キジハタ 中年様 重ねてご指摘ありがとうございます。ご指摘を受けSDSの入っているダイ、入っていないダイを両方試してみました。タカラの6xDye（SDSなし）と10xDye（SDSあり）をそれぞれ1xになるよう加えて見ましたが双方浮いてしまいました。 ちゃんとアプライできている制限酵素消化サンプルやPCR産物に比べて、浮いてしまう脱リン酸化後サンプルは溶液の粘性が高い感触です。液切れが悪いというか、なんかチューブ内にベットリくっついているような感じです。 Tb様 WASH時間が長くなるとエタノールが残ることがあるのですね。勉強になりました。 かなづち様 ローディングバッファというものは多すぎても電気泳動に影響しないものなんでしょうか。なるべく1xに近い方が良いかと思っていました。 色々試しているうちに新しい発見がありました。脱リン酸化反応はCIPの場合37℃、BAPの場合60℃で30分反応させていました。反応産物をカラムにかけず、反応後にローディングダイを加えてアプライすると浮きました。 しかし酵素反応時のインキュベーションなしで、混ぜてすぐ（反応時間ゼロに近い）ダイを混ぜると、きちんと沈みました。 あんまり拘ってもしょうがない事かもしれませんが、よく分からなくなってきました。

(無題) 削除/引用 No.2428-12 - 2010/04/22 (木) 16:59:54 - かなづち DNAを見るだけなら泳動バッファー9μL、DNA1μ混ぜて泳動すれば大抵沈むでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2428-11 - 2010/04/22 (木) 00:04:08 - Tb トピ主さんのケースに参考になるかどうかわかりませんが、QIAGENのPCR purification kitでPCR＆制限酵素処理したサンプルを精製するときに同様の現象が起きました。苦しいPCR mutangenesisだったので250 ulのPCR/DpnI反応溶液（+1 mlくらいのbinding buffer)を2回に分けて１本のカラムにロードしました。しかし、何度やって最後のDNA溶出液にwash bufferからのエタノール混ざり、ゲルにロードすると拡散してしまいました。これはwash stepの遠心を長くしても改善しませんでした。最終的に、2回に分けて遠心法でカラムにロードするのではなく、吸引方式で連続的に1 ml超のサンプルをカラムにアプライするとエタノールの混入がなくなりました。（ちなみにwash stepは遠心法に戻しました）。どうしてこうなるのかわかりませんが、wash stepの長時間化ではエタノール混入が改善できなかったという例として述べておきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2428-10 - 2010/04/21 (水) 22:45:53 - 中年 しつこいようですが、現状ではSDS説はまだ捨てられないと思います。制限酵素反応とCIP処理反応では組成が（例えばタンパク質濃度が）違っているので、粘性というか、チップの先にまとわり付く様子が変わってくるというのは大いに考えられることです。SDSを含んだ粘性のある溶液がいったん一部でも泳動バッファー面に達すると、表面張力の加減かロードしたサンプルが手繰り寄せられるようにウェルから逃げ出すことがあります。一度、SDSを含まないローディングバッファーを試されてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2428-9 - 2010/04/21 (水) 20:53:46 - キジハタ 皆様返答ありがとうございます。 Pumpkin様 電気泳動バッファはたっぷり（ゲルの上面5mmくらい）入れております。また、脱リン酸化後のサンプル以外は今のところ正常にアプライできています。 中年様 ご紹介いただいたトピを読ませていただきました。 サンプルはゲルの底に入るようにして、ゲルをバッファに入れてすぐにアプライしているのですが浮いてきてしまいました。ダイ中のSDS云々の話は他のサンプルがアプライできているので可能性は薄いと思われます。 外様様 私の乏しい生活体験ではなぜ脱リン酸化後のサンプルだけが浮くのかは理解できません。ぜひその生活体験をお聞かせ下さい。 田舎暮らし様 電気泳動槽のバッファは使いまわしていますが、他のサンプルは正常に流れているので濃縮されすぎではないと思われます。 カラム溶出前に加温と溶出後にエタ沈後再溶解を試してみましたが解決せず、やはり浮いてしまいました。 カラムを溶出前に55℃に暖めたブロック上で5分間加温、エタ沈後に減圧乾燥機で5分間乾燥をしました。 今のところサンプルが浮く理由は分からないのですが、脱リン酸化を制限酵素消化と同時にする、という方法にするとゲルにアプライでき、実験は前に進めることができました。 制限酵素バッファとCIPバッファの組成は異なりましたが、ベクターを制限酵素でカット（一箇所）する際に同時にCIPを加えて、ゲル抽出後にライゲーションしたところインサートなしでコロニー1個しか出ず、インサート入りで約百個のコロニーが出たのでちゃんと脱リン酸化されているのかな、と思います。 16コロニーを突いてコロニーPCRすると8コロニーが目的のものと思しき結果でした。明日プラスミド抽出して制限酵素でチェックしようと思います。 ベクター作成ができないという問題は解決しそうですが、なぜ脱リン酸化反応後のみサンプルが浮くのかという問題は全く分からず気になるので、引き続きお答え、ご意見をお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2428-8 - 2010/04/21 (水) 10:39:18 - 田舎暮らし 泳動槽のTAE/TBEが蒸発し、濃縮されすぎているとサンプルが沈まないことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2428-7 - 2010/04/20 (火) 23:27:43 - 小言幸兵衞 外様さん、 ローディングダイまで加えているんだから、そういう話ではないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2428-6 - 2010/04/20 (火) 23:20:30 - 外様 水より軽いものは浮いて、重いものは沈むんですよ。 生活体験が乏しい人なのかな。

(無題) 削除/引用 No.2428-5 - 2010/04/20 (火) 10:37:48 - 中年 似たトピックが以前にありました。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=1220

(無題) 削除/引用 No.2428-4 - 2010/04/20 (火) 10:20:36 - Pumpkin APさんのご指摘通りアルコールが一番怪しいですが、それとともに電気泳動槽のバッファが少なすぎて、ウェルの肩が浸かっていなかったりすると表面張力でバーっとみるみるうちに拡散してしまいます。バッファはけちらず、たっぷりと使いましょう。 ただ、脱Ｐのときだけとなると、この問題ではないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2428-3 - 2010/04/20 (火) 00:34:22 - キジハタ AP様即レスありがとうございます。 エタノールの持ちこみについては懸念したので、WASH後に長時間（トップスピードで5分）遠心してカラムを乾かそうとしたのですが、その程度ではエタノールは完全には飛ばないものなんでしょうか。 �@プラスミド溶液を制限酵素カット ↓ �Aスピンカラムで精製し水で溶出 ↓ �B脱リン酸化反応 ↓ �Cスピンカラムで精製し水で溶出 という流れでやっているのですが、�@の後と�Aの後のものは普通にアプライでき、�Bの後と�Cの後で浮く状況です。 ゲル濾過カラムは今手元にないので、溶出後エタ沈と溶出前加温、というのを試して見ます。

(無題) 削除/引用 No.2428-2 - 2010/04/19 (月) 23:39:56 - AP サンプルにアルコールが持ち込まれている場合によく起こることです。 スピンカラムはシリカマトリックスに吸着させてアルコール含有のバッファーで洗浄するタイプだと思いますが、洗浄バッファーのアルコールがキャリーオーバーしているのではないでしょうか。溶出前に温和に加温してアルコールを飛ばしているでしょうか。溶出液をいったんエタノール沈澱して、アルコールをよく飛ばしてから再溶解してもいいでしょう。あるいはゲル濾過タイプのスピンカラムで精製すればその心配はないです。 脱リン酸反応液を直接サンプルにした場合もそうなるというのが、ちょっとなぞですが、前段階でエタノール沈澱しているなら、アルコールが残っているうちに再溶解したために、脱リン酸反応にアルコールが持ち込まれている可能性は大いにあります。

電気泳動サンプルが浮く 削除/引用 No.2428-1 - 2010/04/19 (月) 23:17:29 - キジハタ 最近プラスミドを触りはじめた遺伝子組み換え初心者です。 ある遺伝子の発現ベクターの作成を行っているのですが、カット済みベクターを脱リン酸化後に電気泳動しようとするとサンプルがバッファ中で浮いてゲルにアプライできない、という現象が起こり原因が分かりません。 脱リン酸化（タカラのBAPあるいはNEBのCIP使用）後に反応液中にダイを入れてアプライした際と、脱リン酸化反応後にDNAをプロメガのスピンカラムで精製して水で溶出し、等量の2xTEと混合したものにダイを加えてアプライした際に浮きました。 沈めようと思ってダイを多めに（6xDyeを等量）入れても浮いてしまいました。 浮くときは一気にバッファ中に拡散する感じではなく、塊のまま水面まで浮いてきて、ゆっくり時間をかけてバッファ中に散る感じです。 制限酵素で切った後に反応液中にダイを入れたものや、切った後にスピンカラムで精製したものをアプライした際には普通に沈んだのでローディングダイや電気泳動バッファは問題ないものと思います。 電気泳動バッファは1xTAE、ダイはタカラの制限酵素に付いていた6xDyeを使用しています。 PCR反応液やミニプレップしたプラスミド、ライゲーション産物などは普通にアプライできているのですが、なぜか脱リン酸化後のものだけ浮いてしまいます。 サンプルが浮く原因、あるいはどうやったら原因が分かるのかにつき、ご教授をお願いします。

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