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(無題) 削除/引用 No.2426-5 - 2010/04/27 (火) 13:06:36 - ま これうちでも起きてます。 変異を中央に入れた完全に相補的なプライマーでリン酸化などしてません。 プラスミドを鋳型にPCR後、DpnI処理、トランスフォームするだけです。 ライゲーションもしてないのに綺麗にタンデムにプライマー部分が １０個程度の挿入しています。幸い８つもコロニーを拾えば １個しか入ってない目的のものが取れているので気にはなるけど 放置してます。 酵素にKOD FXを使っているのが原因かとにらんでいるのですが 確証はありません。

(無題) 削除/引用 No.2426-4 - 2010/04/21 (水) 14:31:24 - 中年 「ligation mixを用いずに」というのは、ライゲーションすらしていないということですよね？ それで完全にタンデムに入るというのは考えにくいです。オリゴの全長ではなくて、部分配列がタンデムになっているのではありませんか？だとしたら、オリゴの配列内にそれを許す相同性があるせいだと思われます。同義コドンを上手く使って、核酸レベルの相同性を下げたプライマーのデザインをしてみてはかがですか？

(無題) 削除/引用 No.2426-3 - 2010/04/20 (火) 23:05:02 - AP どういうパラメータで、そういうことが高頻度で起こるか、ということはさておいて、起こっていることは明らかであるように思います。 プライマー同士がアニールした小分子二重鎖が目的のPCR産物の環状化に際して、ライゲーション部位に挟まってライゲーションされているのでしょう。 ライゲーションの前に低分子を除去する精製（ゲル電気泳動からの切り出しやゲル濾過）をしてみては。それをやらないプロトコールやキットもありますが、やるようになっているのもあります。

(無題) 削除/引用 No.2426-2 - 2010/04/20 (火) 21:38:53 - ザンギ 何が起こってるのか想像しにくいですが、ライゲーションしなくてもプライマー の配列が繰り返されるんなら、PCRでプライマーコンカテマーが出来てるんでは ないでしょうか。 ＋１０っていうのも短い気がします。 配列を変えてみてはどうでしょう。

プライマー配列が変異導入部位に複数個入る 削除/引用 No.2426-1 - 2010/04/19 (月) 20:39:01 - とおます Point mutation (mutationの入った相補的なプライマーを使用し、PCRでプラスミド全体を一周増幅する方法) を行っていますが、変異導入部位にプライマー配列が複数個 (8-14回) 連続的に入ってしまいます。プライマーをリン酸化せずかつligation mixを用いずに形質転換を行うとよいと聞いたのでやってみたのですが、一向に改善されませんでした。そういう経験のある方、いらっしゃいませんか？変異導入部位は18塩基、プライマーは変異導入部位を中心にして10+18+10=38塩基で設計しています。

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