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(無題) 削除/引用 No.2422-10 - 2010/04/22 (木) 17:37:18 - あらあら 特定の人にしかお礼をしないとは悲しいことですね。

(無題) 削除/引用 No.2422-9 - 2010/04/22 (木) 00:07:31 - ami ものすごい参考になりましたし勉強になりました。ものすごいありがとうございました。 masaさん > ただ蛍光強度は確実に落ちるので検出限界以下になってしまう条件も存在すると思います。 その、検出限界以下になるのが、どんな遺伝子が前にあっても起こるのか、特定の遺伝子で起こりやすいのか、経験的にどんな感じかということが知りたい感じでした。なんとなく、わかりました。 Tbさん > 挿入遺伝子の長さはウイルスタイターに影響を与える一つの重要な要因ですが、感染細胞のGFP強度との相関はなく（一定のMOIで感染させた場合）、GFP強度は挿入遺伝子によりまちまちです。GFP強度が変わるのは、mRNAの安定性が挿入遺伝子の配列により異なってくるからだと考えています。 > そして、対象細胞で感染後のGFP強度が弱くなる場合、しばしば感染効率（GFP+ %）も低くなります。これは、パッケージング細胞内においてもプラスミドからのベクターmRNAが相対的に不安定でウイルスタイターが通常より低くしか出ないことによるのだと思います。 理論がわかってきました。かしこくなりました。ありがとうございました。 CSTさんもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2422-8 - 2010/04/21 (水) 12:27:22 - Tb >[Re:7] うさんは書きました : > IRESで目的遺伝子とGFPを発現させて > 目的遺伝子が発現しているかどうかをGFPで判断することについてのこれまでの印象 > 万能ではない。 うさんの経験を尊重した上で、あえて私の経験論を述べさせていただければ、均一な細胞集団に対してtransfection/infectionしているという前提を置けば、ほとんどの場合IRES-GFPは目的遺伝子の発現を正確に反映していると思います。私は手当たりしだいに入れてた時期があり、その時FACSで発現を定量的にはかれるものはみていたのですが、GFP強度と目的遺伝子産物量は直線相関が常にありました。例外として、急速にプロモーターの不活性化が起きている場合、GFP蛍光強度と目的遺伝子によるタンパク量の変動のタイムラグからくるずれがでることはありますが。 おそらくトピ主さんはレトロ／レンチウイルスベクターによる遺伝子導入を述べているのではないかと推測・仮定した上で、 > 目的遺伝子の長さは関係無い、問題はその性質 挿入遺伝子の長さはウイルスタイターに影響を与える一つの重要な要因ですが、感染細胞のGFP強度との相関はなく（一定のMOIで感染させた場合）、GFP強度は挿入遺伝子によりまちまちです。GFP強度が変わるのは、mRNAの安定性が挿入遺伝子の配列により異なってくるからだと考えています。 そして、対象細胞で感染後のGFP強度が弱くなる場合、しばしば感染効率（GFP+ %）も低くなります。これは、パッケージング細胞内においてもプラスミドからのベクターmRNAが相対的に不安定でウイルスタイターが通常より低くしか出ないことによるのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2422-7 - 2010/04/20 (火) 08:21:47 - う IRESで目的遺伝子とGFPを発現させて 目的遺伝子が発現しているかどうかをGFPで判断することについてのこれまでの印象 万能ではない。 この一言に尽きる。 私が確認したことから考えていること 目的遺伝子の長さは関係無い、問題はその性質 明らかに細胞に毒性がある場合は論外だが、 一目でそうかどうかは細胞に聞いてみるしかわからない。 GFPの発現が弱かったときと目的遺伝子の長さは相関関係はなかった。 たとえ、GFPが発現していようが、目的遺伝子が同じくらい発現しているとは限らない。 原理はよくわからない、しかし、実際あったのだからしょうがない。 ＞でも、ただそれだけのことでGFP(+)の細胞が50%とか、30%とか、あるいは10%とかまで低くなるのかどうか だた、この質問の意味は未だにわかりません。 ただそれだけことって何です？ あと、これを言ったらおしまいかもしれませんが、至言だと思うのであえて。 ヒトが「こうなるはず」と考えて作ったコンストラクトを細胞に導入して 予想通りにならかかったとして、それは原因はどうあれ、そうなるのだからしょうがないのでは？ 私は、先に示した経験を踏まえて利用しています。

(無題) 削除/引用 No.2422-6 - 2010/04/19 (月) 21:03:25 - masa こんにちは。 個人的な感覚ですがIRESの前に挿入するcDNAの長さの影響を結構受けるような印象があります。 私が実験した際には1-2kbp位のcDNAであれば蛍光顕微鏡で観察した際のGFP陽性細胞の割合は、プロモーター直下にGFPを挿入してトランスフェクションしたプラスミドの場合とそれほど変化しないように感じました。 ただ蛍光強度は確実に落ちるので検出限界以下になってしまう条件も存在すると思います。

(無題) 削除/引用 No.2422-5 - 2010/04/19 (月) 20:41:36 - ami > IRESの有無でどれほどGFPのMFIは違うのか まさにそういうことです。ちょっとやってみた感じでは、ぼちぼちGFPの発現がしょぼいなぁ、これじゃぁ目的の遺伝子が入っていてもGFP(-)の細胞とか結構いそうだなぁ、GFPを指標に導入効率は判断できなさそうだなぁ、という感じを受けたのですが、そういう感じなのかどうか、やっている方に聞いてみたかったという感じです。

(無題) 削除/引用 No.2422-4 - 2010/04/19 (月) 15:04:31 - いえいえ うさん amiさんが仰りたいのは、IRESの有無でどれほどGFPのMFIは違うのかということですよ。

(無題) 削除/引用 No.2422-3 - 2010/04/19 (月) 14:26:28 - う ？？？ どうして導入された細胞では、GFPの発現は高いというのが前提なのでしょうか？ 導入されていても、その程度によって発現は変わるでしょうし。 その検出をする感度によって発現を感知できるかどうか変わるでしょうし。 ？？？ 何が疑問なのかもう少しわかりやすく願います。

(無題) 削除/引用 No.2422-2 - 2010/04/19 (月) 12:37:27 - CST amiさん、いつもお世話になってます。 私は、pMXsベクターに「geneA-GFP」をcloningし（AのC末にGFPが融合）、それをpackaging cellsへlipofectionしたところ、GFP+の細胞のMFIは、800前後でしたが、pMXsーIGベクターに「geneA」をcloningし（A-IRES-GFP）、それをpackaging cellsへlipofectionしたところ、GFP+の細胞のMFIは、約80ほどまで落ちました。 ちなみにGFPが完全にnegativeな細胞でも、negative sortしてRNAレベルでGFPの発現を見ると、それなりにちゃんと出てます。

IRES-GFPってどれくらいGFP(+) 削除/引用 No.2422-1 - 2010/04/19 (月) 11:44:35 - ami お世話になっております、最近分からないことだらけで聞き倒しですいません。 目的の遺伝子 - IRES - GFP っていうコンストラクトが、例えば100%すべての細胞にちゃんと導入されたとして、GFP(+)になる細胞の割合は100%ですか。 IRESのあとの遺伝子の発現量がまちまちだったり、落ちたりするのは知ってます。そういうのでGFPが検出できないくらい少ない発現量になって、GFP(-)になる細胞がありそうなのも想像がつきます。でも、ただそれだけのことでGFP(+)の細胞が50%とか、30%とか、あるいは10%とかまで低くなるのかどうか、経験があればお聞きしたいです。想像では、75%くらいにはなるんじゃないかなぁ、と思うのですが。 よろしくお願いします。

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