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(無題) 削除/引用 No.2419-4 - 2010/04/21 (水) 11:22:45 - はる ご返答頂きまして、ありがとうございました。 回答が遅れまして申し訳ございません。 １．DNA FISHですか？RNA FISHですか？ 　→DNA　FISHを行っております。 ２．検出の蛍光色素は何を使っていますか？ 　→申し訳ありません、Vysisという会社のプローブを使用しているのですが、私が探した限り蛍光色素の名称記載がなく、Spectrum 〜(Aqua,orange,green等)という記述しか見つけることができておりません。私も気になって大分調べたのですが、至らずにお恥ずかしい限りです。 ３．カウント方法をもう少し詳細に書いてください 　→これも、私なりに色々試してみたのですが、上手い方法がみつかりません。当初は顕微鏡に搭載されている機能を使い、位置を少しずつずらした画像を連続撮影してつなぎ合わせ、極力蛍光観察の時間を短くしようと思ったのですが、そうするとつなぎ合わせた撮影画像の両端にくるもの間でピントがずれてしまい、明瞭なシグナルを得られず断念しました。手動1枚ずつピントを合わせて撮影するとなると、それこそ撮影の露出時間が60secとした場合、フィルター切り替えを合わせると撮影時間が1枚2分以上かかってしまうので、いっそのこと撮影せずにカウントするほうが速くてよいのではないかと考えております。私が蛍光顕微鏡を使いこなせていないだけなのでしょうか・・・。 ４．閾値設定に関して 　→ご助言、ありがとうございます。この分野における「一般常識」が分からず、悩んでおりました。ぜひ参考にさせて頂き、指導教官の先生とよく話し合ってみます。 つたない説明で申し訳ありません。 どうぞ宜しくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2419-2 - 2010/04/19 (月) 10:28:00 - in situ 陽性細胞数をカウントするということはしたことがないのですが、FISH自体の経験はあります。 １．DNA FISHですか？RNA FISHですか？ ⇒条件検討の仕方とか、シグナルが弱いということの意味も変わってきますので、書きましょう。 ２．検出の蛍光色素は何を使っていますか？ ⇒FITCとかローダミンとかだと退色が激しいと思います。退色がひどいようでしたら、Alexa系とかを使うことをお勧めします。 ３．カウント方法をもう少し詳細に書いてください ⇒一回撮影してから画像上でカウントするという方法だと退色はそれほど心配することがないと思いますが、どうやっていますか？ ４．閾値設定に関して ⇒ここら辺は自分で設定するしかないのですが、陰性のコントロールを用意して、その細胞がきちんと陰性と判定される条件で決めればよいと思います。シグナルが弱くてもバックと区別できるものに関しては陽性と判断するのが普通だと思いますが、実験の目的により、特に強発現のものを陽性と判断するのであれば話は別です。ここら辺は、実験目的を指導教官の方とよく話し合いましょう。

FISHシグナル観察について 削除/引用 No.2419-1 - 2010/04/18 (日) 21:18:06 - はる 以前もこちらでお世話になりました。 実験初心者のはると申します。 現在、ある市販のプローブを用いたFISHにおいて、 シグナル陽性の細胞をカウントし、細胞1000個に対する陽性率を求める実験を行っているのですが、その際の条件設定に困っています。 うちの研究室の蛍光顕微鏡は、露出時間の設定が出来るのですが、 かなり露出時間を長く(30〜60sec)しないとシグナルが検出できない細胞と、ある程度短い露出時間でもシグナルが検出できる細胞があります。 こういった実験で陽性率を求める場合、露出時間を限界まで長くしたものでも陽性、としたほうが良いのでしょうか。この場合、バックとノイズが高いのですが、大丈夫なのでしょうか。 それとも、全ての検体を観察する際の露出時間をあらかじめ決めてしまって、そこを境として陽性・陰性と分けたほうが良いのでしょうか。 また、両法に共通の不安ですが、1000個もカウントしていると、褪色が起こって後半のシグナルに影響が出るのではないかと心配しております。 周囲に、FISH経験のある方がおらず、基礎が分からないため実験書頼りの手探りの状態です。 経験のあります方、ご教授願えましたら幸いです。 長文、失礼いたしました。

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