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(無題) 削除/引用 No.2414-9 - 2010/04/20 (火) 07:54:20 - 困った TSさん，確かにTritonでもいけるということは，Tweenでもいけそうですよね。最低１０分くらいは界面活性剤でincubationしないとPermeabilizationされないと思っていたので，２分でも大丈夫，と聞いて驚きました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2414-8 - 2010/04/20 (火) 00:41:15 - ＴＳ >0.2％Tweenで２分でもPermeabilizationされるとは驚きです あ、すみません。私は、0.2% Tritonでやってます。 Tweenを使ってるって書いていたので、まぁいけるかな、と思った程度です。

(無題) 削除/引用 No.2414-7 - 2010/04/20 (火) 00:29:07 - 困った TSさん，APさん，アドバイス，ありがとうございます。参考にさせていただきます。それにしても，0.2％Tweenで２分でもPermeabilizationされるとは驚きです。試してみます。

(無題) 削除/引用 No.2414-6 - 2010/04/19 (月) 23:12:01 - AP この場合、原因に当てはまるかどうかわかりませんが、 GFPは有機溶媒にめっぽう弱いです。各種アルコール、キシレン、アセトンなどの溶媒などにさらすと光らなくなります。 もし、固定標本をマウントする過程で、アルコールで脱水したり、有機溶媒系のマウント剤を使ったり、カバーグラスの周囲をマニキュアで封じたりしているなら、それが原因で光らなくなったということが考えられます。 有機溶媒で処理する必要がある場合、あるいは蛍光性をより安定に保持したい場合は、抗GFP抗体を使った蛍光抗体染色法を選びます。

(無題) 削除/引用 No.2414-5 - 2010/04/18 (日) 11:27:34 - ＴＳ どのようなことをねらっているのか少々不思議ですが、なぜ一般的なプロトコールではダメなのですか？ 再固定とかの意味がよく分かりません。 たとえば、3-4％PFA固定（１０分間）、0.2%Tween 2分間で免疫染色に持って行くやり方ではうまくいかないのでしょうか？ GFPのシグナルは、そのくらいならそれなりに残ると思いますし、シグナル増強のためにAnti-GFPを使うのも一般的かと思います。 もしかしたら、PFAが細胞内に浸透しないと考えておりますか？ PFAは、Permeabilization前でも細胞内に浸透して、タンパク質を固定しますよ。

(無題) 削除/引用 No.2414-4 - 2010/04/18 (日) 11:02:42 - 困った DDDさん，小栗さん，ありがとうございます。固定の条件を強くしてみます。 細胞内のタンパク質を検出したいので，固定後，界面活性剤での処理は必須なのですが，界面活性剤でGFPが流出してしまうことがあるのですね。例えば，２％パラホルムアルデヒドで固定，界面活性剤処理，２％パラホルムアルデヒドで再固定，としてみた方はいらっしゃらないでしょうか？固定の条件が強すぎて，細胞内の抗原性が低下しないでしょうか？ もしご存知の方がいらっしゃったら，お願いします。

(無題) 削除/引用 No.2414-3 - 2010/04/18 (日) 04:25:00 - 小栗 0.2% paraformaldehydeはかなり弱いですね。2% paraformaldehydeで１５分RT、wash with PBS　３x, で大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.2414-2 - 2010/04/17 (土) 17:50:24 - DDD 細胞に穴をあけて長時間置くとGFPが漏れるってのは聞きますが… 固定→界面活性剤の流れであれば 固定強くしてみてはいかが？

固定と界面活性剤でGFPシグナルが消えますか？ 削除/引用 No.2414-1 - 2010/04/17 (土) 17:37:05 - 困った GFPを強発現させた細胞をFACSや蛍光顕微鏡で観察すると，未処理の状態ではGFPを確認できるのですが，0,2%パラホルムアルデヒドや0,2%Tween-20で３０分ほど細胞を処理すると，GFPシグナルが消えてしまうのですが，同じような経験のある方はいらっしゃるでしょうか？どのようにしたら，固定や界面活性剤でGFPシグナルを保持させることができるでしょうか？お願いします。

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