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(無題) 削除/引用 No.2412-10 - 2010/04/21 (水) 19:36:27 - 実験初心者 mouseさん お返事が遅くなってしまい申し訳ございません。 いろいろと教えていただいてありがとうございます。 いろいろと試してみようと思います。 まずは、先に進めてみます。

(無題) 削除/引用 No.2412-9 - 2010/04/18 (日) 13:57:33 - mouse Percollの比重の違いは検討したことがありませんが、 どの臓器にも当てはまりますが、単核球の分画から MACSやFACSでpurityをあげることが必須だと思います。 Percollの代わりにoptiprepを用いれば、比重遠心の 段階で収率があげられるかもしれませんが、肝臓では やったことがありません。 比重遠心後の分画をそのままDC/macrophageとしている paperもありますが、下記のpaperのようにoptiprep後に sorした方がいいと思います。 The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice Jiangao Zhu, Xiaopei Huang and Yiping Yang http://www.miltenyibiotec.com/jp/Forum_replies.aspx?threadId=1217

(無題) 削除/引用 No.2412-8 - 2010/04/18 (日) 06:39:44 - 実験初心者 mouseさん、こうじさん アドバイスありがとうございます。 percollが高価なもののため、使う前に鏡検していたのが、逆効果だったのですね。 先に進んでみることにしてみます。 セルストレイナーもどのようなものかは見てはいたのですが、なにぶん高価なもので、金属メッシュでされている方もたくさんおられるということで、この方法を採用しました。 お恥ずかしながら、小さなラボで、予算もあまりなくて。。。 先に進むにあたり、もう一つ質問なのですが・・・ いろいろな文献を参考にさせていただいているのですが、文献によってpercollの使用％が違います。 今回、私はMφ（クッパー細胞）を分離したいのですが、参考までに皆さんはどのような濃度で使用されているのか教えていただけないでしょうか。 また、何ml分注されているのかも教えていただければありがたいです。 なにぶん、肝臓を扱うのが始めてなので、簡単な質問ばかりで申し訳ないのですが、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2412-7 - 2010/04/17 (土) 19:24:09 - こうじ 金属メッシュでやっています。 メッシュの上でいきなり押しつぶさず ハサミで細かく裁断してみてください。 あと、書かれている条件に近い方法で調製していますが リンパ球はあまり取れませんよ。 マウス１匹の肝臓を全部取ってきても ６乗あるかどうかぐらいになると思います。 他の細胞の生死を見ても仕方ないと思いますし 先へ進んでみても良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2412-6 - 2010/04/17 (土) 18:20:04 - mouse こんにちは。 比重遠心前にで鏡検されていますが、リンパ球以外の細胞やごみも 混じっているので、死細胞が多く感じるのではないでしょうか？ もし比重遠心後でしたらすみません。 金属メッシュは使用したことがないので分かりませんが、セルストレイナーの上で細切した小切片を優しくすりつぶし、PBSでwashする感じでやってました。 またはディッシュ上でスライドガラスのざらざらした側ではさんで小切片を すりつぶし、細胞が溶解した液ごとナイロンメッシュに通していました。 BDのセルストレイナーは高いので使い捨てせずに洗ってオートクレーブして再利用するか、普通のナイロンメッシュを使うのがいいと思います。 あまり良いアドバイスはできませんが、がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.2412-5 - 2010/04/17 (土) 16:28:40 - 実験初心者 mouseさん ありがとうございます。 紹介していただいたトピックスは以前拝見させていただいております。 そこでも金属メッシュを使用と書いてございましたので、採用させていただきました。 しかし、うまくいかなくて困っています。 指導教員に相談しながら、いろいろと改善しているのですが、なぜ死んでしまうのかがわかりません。 もし、考えられる改善点があれば教えていただけると幸いです。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2412-4 - 2010/04/17 (土) 12:34:42 - mouse http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2537 http://www.bdbiosciences.com/nvCategory.jsp?action=SELECT&form=formTree_catBean&item=619502 参考に以前の書き込みとBDのcellstrainerのリンクです。 うちのラボでは100か70マイクロを使っています。

(無題) 削除/引用 No.2412-3 - 2010/04/17 (土) 11:23:17 - 実験初心者 報告さん ありがとうございます。 試してみたいのですが、うちのラボにはなかったように思います。 購入を考えてみたいのですが、何Gのナイロンメッシュを使っておられましたか？？ また、価格もわかれば教えていただければ幸いです。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2412-2 - 2010/04/17 (土) 09:51:49 - 報告 金属メッシュは私の場合避けていました。 ナイロンメッシュでやれないのでしょうか？ 私は6 cm dishかなにかにmedium入れて、シリンジのおしりで押しつぶし、重い組織片を軽く落とした後、上清をナイロンメッシュでこしていました。 その後、ficollにかけてました。

肝臓の細胞懸濁液の作り方 削除/引用 No.2412-1 - 2010/04/17 (土) 09:45:23 - 実験初心者 すみません、失礼いたします。 初歩的な質問で申し訳ないのですが、もし分かられる方がおられましたら、 回答いただけるとありがたいです。 今、肝臓からリンパ球を分離しようと試みています。 方法は以下の通りです。 �@ 大静脈からPBSを灌流洗浄する。 �A 肝臓の一部を取り出し、はさみで切れ込みを入れる。 �B 金属メッシュに肝臓をのせ、シリンジの内筒を使いすりつぶす。 �C 懸濁液をチューブに入れ、500 rpm、4 ℃、1 分間遠心分離し、肝臓片を　 取り除く。 �D 次に、1000 rpm、4 ℃、10 分間遠心分離する。 　　　　　　　　　　・ 　　　　　　　　　　・ 　　　　　　　　　　・ この後も続くのですが、とりあえずこの段階で細胞を観察します。 トリパンブルーで染色し観察を行っています。 観察をすると、この段階で細胞がほとんど死んでしまいます。 メッシュでこするときにも細心の注意を払ってはいるのですが、どうもうまくいきません。。。 培養液もいろいろと試しているのですが、ダメでした。 いろいろな論文を読ませていただいても、この方法でされているのがほとんどです。 なぜ細胞が死んでしまうのでしょうか？？ どうすれば、生きたまま細胞を分離することができるのでしょうか？？ 教えていただければ幸いです。 よろしくお願いいたします。

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