全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2410-4 - 2010/04/26 (月) 13:57:33 - ANRIS APさま、emaさま、ありがとうございます。 使用している顕微鏡では、liveの状態で見るようなシステムは付いてないので、固定はどの道必要になると思いました。 PIとHoechstで染めている論文はあるのですが、固定をしていなかったり、細かいプロトコルが書いてなかったりまちまちで、常套的な方法がわかりません。 APさまがおっしゃるように、固定前に染色してみましたが、細胞が剥がれやすくダメージのある細胞が浮いてしまっているようでした。 条件を変えて見やすくなるように検討しているところです。 emaさまのご紹介いただいた資料もどのように染まるのか参考になりました。 ありがとうございました。

GEのページに 削除/引用 No.2410-3 - 2010/04/19 (月) 22:25:50 - ema FACSのデータがほとんどなんですが GEのページにHoechst 33342、Annexin V、PIで染めた絵つきのがありました。 http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/cellular_science/pdf/328211.pdf

(無題) 削除/引用 No.2410-2 - 2010/04/19 (月) 11:59:13 - AP この場合、無固定の状態で染色するのではないかな。 死細胞を染色で弁別する多くの方法と同様、PIが、生きている細胞では多剤排出系が働いているので浸透せず、死んだ細胞のみDNAが染まるという原理で。一方Hoechst33342は生細胞にも浸透するので、生きた細胞でも死んだ細胞でも染色できるカウンターステインとして使っているのでは。もし固定が必要なら、染色後にやるんじゃないでしょうか。

顕微鏡によるアポトーシス判定 削除/引用 No.2410-1 - 2010/04/17 (土) 01:45:58 - ANRIS Hoechst33342とPropidium iodide(PI)による培養細胞の染色でアポトーシスを判定しようとしてます。 染色と判定の方法で疑問があり質問させていただきます。 細胞はHEK293で、薬剤処理によってアポトーシスを誘導しています。 染色方法は・・・ ・正立型顕微鏡使用のため、3.5cm dishにカバーグラスを敷き細胞を培養。 ・培養後培地を捨て、4% PFAに置換して室温で30分固定。 ・PBSで2回洗浄後、終濃度 1ug/mL Hoechst33342と2.5ug/mL PIの混合液で 15分間室温暗所で染色。 ・PBSで4回洗浄後、ピンセットで細胞の載っているカバーグラスを取り出　 　し、マウント液（DABCO入りグリセロール）を載せたスライドグラスに載せ　る。 ・カバーグラス周囲をマニキュアでシールする。 ・顕微鏡で40倍または60倍で観察。 判定の方法は・・・ ・固定後に染色しているので、PIでは細胞すべてが染色される。 ・Hoechst33342は生細胞、アポトーシス両方で染まるので、固定した場合は　生細胞以外のアポトーシス細胞のみが染まる。 →両方で染まった細胞のみアポトーシス？ もしくは ・固定後に染色しているので、PIでは細胞すべてが染色される。 ・固定で細胞が生きている状態のままで構造が保たれているので　 　Hoechst33342は生細胞は網目状に、アポトーシスはクロマチン凝縮のため　濃く染まる。 →PIで細胞が断片化もしくは小さくなっているのが見え、尚且つ　 　Hoechst33342で濃く染まっている細胞がアポトーシス？ 何度か試しに染色しましたが、うまく判定できません。 薬剤処理の結果、生細胞が半分にまで減るのを他の方法で確認しているのでアポトーシスが起きているだろうと予測しています。 アポトーシスが起きることは論文で報告されています。 Hoechst33342、PIともに核を染まっているのは見えますが、薬剤処理した方の細胞でアポトーシスらしき状態が顕著に増えている状況が見えませんでした。 サンプルの作成方法、またアポトーシスの判定の方法に自信がないので、ご経験の方がいらしましたら、おかしな点、改善点などご指摘してください。 よろしくお願いします。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---