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ChIP：断片化DNAの確認 トピック削除
No.2409-TOPIC - 2010/04/16 (金) 16:37:59 - GE
いつも参考にさせていただいています。

今回、クロマチン免疫沈降（ChIP）に関してアドバイスを頂きたいと思い、書き込みました。

現在、ChIPのソニケーション後に、サンプルを脱クロスリンクし、精製した後、DNAの断片化を確認するためにアガロース電気泳動をしています。
電気泳動は1%アガロース、TAEを使ってMupidで100Vで行っています。

その際、泳動するDNAの量を0.5、2、4、8ugで行っているのですが、DNA量が少ないほど高分子側（3kbp程度）に多くのDNAがみられます。逆に、量を多くすると0.2-1kbpにラダーなバンドが強くみられます（一部スメアになっています）。

また、泳動時間を長くしていけばいくほど、低分子に見られていたバンドも上にシフトしていきます。例えば、8ugのDNAの場合、20分の泳動だと上記のような感じになるのですが、30分の泳動だと、1.5kbpあたりにバンドの中心が来ます。

そこで、ChIPをされている方にお伺いしたいのですが、どのような電気泳動の条件でDNAの断片化を確認されていますでしょうか？また、上記で述べたような現象が見られたことはございますでしょうか？

DNA断片化の確認条件を固定するために、アドバイスいただければ幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.2409-8 - 2010/04/20 (火) 19:52:47 - GE
ema様
アドバイスありがとうございます。


とりあえず、後染めでやってみたところ、泳動量にかかわらず、すべて3kbpあたりにDNAがみられました。
後染めでないといけないということがわかりました。初歩的な点でお手数おかけしました。


現在のソニケーションの条件では、ソニケーションの時間を長くしてもあまり3kbp以下の断片が得られません。また、実験系の都合上、3kbpの断片を用いて実験しても問題ないと考えています。

そこで質問なのですが、通常のChIPだと200-1000bpあたりまで断片化すると思うのですが、何kbpぐらいの断片までを免疫沈降できるかどなたかご存知でしょうか？

また、今後の参考として、皆様がクロマチンDNAの断片化に際して参考にされている論文・マニュアル等があればお教えいただきたいと思います。

あまり参考にならないかもしれないけど 削除/引用
No.2409-7 - 2010/04/19 (月) 21:55:54 - ema
ChIPの断片化はソニケーションで500bp前後のを作成するというプロトコールで私は実験したので２％のアガロース電気泳動でやっていました。サイバーで後染めでした。
ChIPonChipのアレイでは抗体によっては微量のIPしかとれなかったので高いけどAgilent2100バイオアナライザーを使用してチェックしました。

(無題) 削除/引用
No.2409-6 - 2010/04/17 (土) 09:21:46 - GE
けい様、nnn様

ご返答ありがとうございます。
エチブロは使えないので、一度、サイバーグリーンで後染めでやってみようと思います。

ちなみに、他の点で注意されている方おられますでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.2409-5 - 2010/04/16 (金) 18:56:36 - nnn
SYBR Greenは、先染めが難しかったような・・・

(無題) 削除/引用
No.2409-4 - 2010/04/16 (金) 17:19:46 - けい
私が以前DNA断片化の確認をしていたときは後染めしました。

先染めではDNA断片化の確認は行ったことがないのですが、エチブロの場合、低分子側から高分子側にかけて全般的に観察されたいのでしたら後染めした方が均一にむらなく染まると思います。

サイバーグリーンがエチブロと同じ挙動をするかどうかはちょっと分かりません。

(無題) 削除/引用
No.2409-3 - 2010/04/16 (金) 17:08:18 - GE
けい様

ご返答ありがとうございます。
確かに、サイバーグリーン入りのゲルで電気泳動しております。

皆様は、ChIPのDNA断片化の確認の際には、後染めでされていますでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.2409-2 - 2010/04/16 (金) 16:52:43 - けい
エチブロでDNAを確認されていますか？
もし先染め（ゲルにエチブロを入れている）しているのでしたら、泳動とともにエチブロも移動するので染まり方は変わると思います。

ChIP：断片化DNAの確認 削除/引用
No.2409-1 - 2010/04/16 (金) 16:37:59 - GE
いつも参考にさせていただいています。

今回、クロマチン免疫沈降（ChIP）に関してアドバイスを頂きたいと思い、書き込みました。

現在、ChIPのソニケーション後に、サンプルを脱クロスリンクし、精製した後、DNAの断片化を確認するためにアガロース電気泳動をしています。
電気泳動は1%アガロース、TAEを使ってMupidで100Vで行っています。

その際、泳動するDNAの量を0.5、2、4、8ugで行っているのですが、DNA量が少ないほど高分子側（3kbp程度）に多くのDNAがみられます。逆に、量を多くすると0.2-1kbpにラダーなバンドが強くみられます（一部スメアになっています）。

また、泳動時間を長くしていけばいくほど、低分子に見られていたバンドも上にシフトしていきます。例えば、8ugのDNAの場合、20分の泳動だと上記のような感じになるのですが、30分の泳動だと、1.5kbpあたりにバンドの中心が来ます。

そこで、ChIPをされている方にお伺いしたいのですが、どのような電気泳動の条件でDNAの断片化を確認されていますでしょうか？また、上記で述べたような現象が見られたことはございますでしょうか？

DNA断片化の確認条件を固定するために、アドバイスいただければ幸いです。
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