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(無題) 削除/引用 No.2408-6 - 2010/04/19 (月) 21:50:32 - toyo 横レス失礼します。 ブロッキング液の変更でうまくバンドが出たとのこと、良かったですね。 >blockingはskimでやるのに、1st Abを当てる際にはBSAを使う理由がわかりません。。 古典的な説明としては、抗リン酸化抗体の場合、スキムミルク中に大量に 含まれているリン酸化カゼインへの非特異的な吸着を避けるため、 1st Abの希釈をBSAで代替するということらしいです。 元の質問に照らして言えば、1st Abへのスキムミルクの持ち越しを防ぐために washをする必要があるのではないかと思います。 >なぜblocking用材がBSAとskimで違うと結果にこうも影響してしまうのでしょうか？ スキムミルクは雑多なタンパク質の集合体なので、BSAよりもブロッキング 能力が高く、ノンスペが減るのかなと勝手に思っています。

(無題) 削除/引用 No.2408-5 - 2010/04/17 (土) 16:31:15 - CST 報告させてください。 CSTから抗体を購入し、過剰発現させた細胞からタンパクを抽出し、WBを行いました。 ところが、product sheetにあるようなbandは検出されませんでした。 そこで、 （従来） blocking：5 % BSA + 0.1 % Tween20 in TBS 1 st Ab希釈：5 % BSA + 0.1 % Tween20 in TBS で行っておりましたが、CSTのtechnical supportおよびここで皆様にご指摘いただいた方法で （今回） blocking：5 % skim + 0.1 % Tween20 in TBS 1 st Ab希釈：5 % BSA + 0.1 % Tween20 in TBS で、行いました。するとspecificなbandが出現しました！！ みなさまそして、CST様ありがとうございました。 しかし、なぜblocking用材がBSAとskimで違うと結果にこうも影響してしまうのでしょうか？ 個人的に理解出来ないのが、blockingはskimでやるのに、1st Abを当てる際にはBSAを使う理由がわかりません。。 あまりこういったことは気にしなくてもいいのでしょうか？ こういった事が抗原に依るのか抗体に依るのかもよくわかりませんが、もしご存知の方がおられれば教えてくださいませんか？お願いします。

(無題) 削除/引用 No.2408-4 - 2010/04/16 (金) 15:40:19 - CST みなさまありがとうございます！ ご指摘のように洗ってみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2408-3 - 2010/04/16 (金) 13:56:17 - TS CSTの場合、リン酸化抗体などで、ときどきあるプロトコールですよね。 たしか、データシートに書いてありますよ。３回くらい、洗ってくださいとかそんなのが。

(無題) 削除/引用 No.2408-2 - 2010/04/16 (金) 13:43:10 - ああああ 自分は、どんな場合でもblockingのあとにTBS-Tなどでmembraneを軽く濯いでます。

blocking bufferと1st Abの希釈bufferが違う時に 削除/引用 No.2408-1 - 2010/04/16 (金) 13:34:39 - CST みなさまいつも大変お世話になっております。 この度、新たにCSTよりwestern blot用の抗体を購入いたしました。 しかし、product sheetにあるようなspecificなbandは選出されませんでした。 そこで、CSTにその抗体の使用法について伺ったところ、 blocking bufferは、「5 % skim milk in TBS-T」で行い、 1 st Ab (CST)の希釈を、「5 % BSA + 0.1 % Tween 20 in TBS」で行うようにとの回答をいただきました。 みなさまにお聞きしたいのは、上記したようにblocking bufferはmilkで、1 st Ab希釈bufferがBSAのような場合、blocking終了後、何かで（例えば、0.1 % Tween 20 in TBSなどで）membraneを洗う必要はあるのでしょうか？ みなさまの経験を教えていただけますと幸いです。宜しくお願いします。

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