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(無題) 削除/引用 No.2402-3 - 2010/04/16 (金) 10:27:55 - AP TOP10は、lacIリプレッサーがない（IPTGを入れなくてもX-Galが発現して青くなる）タイプだったと思いますが、pET101はlaqOでleakyな発現をよりいっそう抑える設計です。TOP10ではleakyな発現を起こした産物が増殖を妨げている可能性があります。コンストラクトをつくる段階ではリプレッサーの活性がより強いlaqI^qをもつ宿主（たとえばXL-1 blue）にしたほうがいいのではないでしょうか。 pETシリーズはもともと、発現産物が負荷をあたえるのを防ぐため、あえてコピー数の低いpBRを骨格にしています。ふつうにやると高コピーのプラスミドより、1/5〜1/10程度の収量だと言うことは念頭に置いていますよね。

(無題) 削除/引用 No.2402-2 - 2010/04/15 (木) 16:21:08 - ばいや ここでたくさん書かれています。今も別のトピで。 探索して分からなければどこが違うのか書いてもう一度たずねてください。

大腸菌は増えるのにプラスミドが取れない 削除/引用 No.2402-1 - 2010/04/15 (木) 15:35:30 - なるた 現在インビトロジェンのChampion pET Directional TOPO Expression Kitsを使ってpET101/D-TOPOベクターへのある遺伝子のクローニングを試みています。 マニュアルに従ってLigation→TOP10へTransformation後、カルベニシリン100ug/mL入りLBプレート上で生育させました。 コロニーは問題なく多数生育し、カルベニシリン100ug/mL入りLB液体培地で一晩培養後、プラスミドを抽出しました。菌は十分増えていました。 が、アルカリSDS法でもQIAGENのQuickLyse Kitでもプラスミドが取れません。 泳動するとクリアな１本のバンドではなくスメアなブロードバンドがうっすら、という程度です。 どなたか解決策をご存じでしたらご教授下さい。

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