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(無題) 削除/引用 No.239-14 - 2009/04/13 (月) 19:19:13 - ヒストンの検出条件設定中 だめだめさん。 PAGEに用いているゲルの厚さとアクリルアミドの濃度の最適化を図ってみてはいかがでしょうか。 多少、トリッキーな事はしていますが、僕はこれでうまく行きました。

(無題) 削除/引用 No.239-13 - 2009/04/03 (金) 17:07:45 - p 何故ヒストン量を一定にしなければならないのかわかりません。 通りすがりさんや、名無しさんの指摘がマトを得ていると思うのですが？ 今イチ、質問者さんのやりたいことがわかりません。半年間何が問題なのか？

僕も条件設定中です。 削除/引用 No.239-12 - 2009/03/31 (火) 21:59:09 - ヒストンの検出条件設定中 僕も脳組織から抽出したサンプルを用いて、ヒストン修飾レベルの定量を試みています。 これまで、 神経細胞において豊富に存在しているタンパク質（転写因子）などは スタンダードなプロトコルでリン酸化レベルを定量する事はできましたが、 ヒストンは分子量が低く、電荷していることから、 タンパク質としての性質的にも、特殊であるようで、 従来のプロトコルではヒストンの検出は難しく、 適した条件を見つける事が重要であると感じています。 （同一の抗体で、チャレンジしているためかもしれませんが、 ChIPアッセイはできても、ウエスタンブロットではできなかったりします。） 現在、条件設定中ですので、 なにか、いいmethodが見つかりましたら、ご報告させていただくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.239-11 - 2009/03/29 (日) 08:28:49 - 名無し ヒストンのウェスタンのときトランスファーバッファーに0.01-0.03%程度のSDSを入れてますか？CAPS　buffer (pH11くらい）とか使ってみましたか。転写には問題ないならば気にしなくていいですが、もし転写が怪しければ転写条件を変えてみたらどうでしょうか。とくにH4はうまく転写できないときがあります。 あとインターナルコントロールと書いていますが、文脈から考えると、おそらくH3あたりの修飾H3の割合をヒストンH3修飾体シグナル/トータルH3シグナルでみたいということのように察します。よって前の人も指摘しているように仮にサンプル間でばらついても結局は補正されるのではないかと思うのですが。ここに半年を費やすのはあなたのプロジェクトの円滑な進行にもあまりよくないと思いますので、何を調べたいのか、とりあえず今は最低限どんなデータが必要で、何は当座は必要ではないか、プロジェクト各部分へのエネルギー配分を含めてその辺をいまいちど再考してみた方がよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.239-10 - 2009/03/28 (土) 19:27:55 - 名無し 高校生物あるいは大学の基礎の生物学で習ったように、脳や脊髄は白質と灰白質に分かれます。神経細胞体は灰白質（脳の表層のほう）に多く集まっているのに対しいわゆる神経繊維は白質（脳の内部側）に多く集まっています。つまり核は脳の組織全体に均一に分布しているのでない点で肝臓など他の組織とは少し事情が違うとおもいます。全脳をホモジナイズしているならともかく、もし部位に分けたりあまり考えずに適当に切り出していると灰白質の含まれる割合により核タンパク質やMBPの割合も変わってくるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.239-9 - 2009/03/27 (金) 19:36:36 - だめだめ すいません。プロトコルに書き忘れていました。 ホモジェナイズした後，遠心する前にBioruptorを用いて4℃, 10secON/10secOFF, total time 5minの条件でsonicationしています。 rotation抽出することによって均一に可溶化させるということは考えていませんでした。試してみます。

(無題) 削除/引用 No.239-8 - 2009/03/27 (金) 19:17:36 - み ヒストンは相手にしたことないですが、他に留意すべき点は、 SDSバッファーでホモジナイズされていますが、その条件でＤＮＡに強固？に結合しているであろう蛋白が十分かつサンプル間でバラツキなく可溶化されているかが気になります。 おそらくDNAが糸を引く感じがあるのではないでしょうか。 Sonication後、20-30min,rotation抽出したりする必要性はないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.239-7 - 2009/03/27 (金) 18:54:48 - だめだめ ピペッティングの誤差を減らすために，1μg/μlのサンプルを10倍希釈して5μl/laneアプライしています。 > ECL-plusは感度良いから少量でも検出限界以上に達するかもしれませんが、十分量をアプライし、exposeもしっかりした状態で視覚的にも差があるのか、一定なのかを判断すべきでは。 たしかにそう思います。5μg/レーンで検出すると，バンド同士がくっつく上に，saturationしやすいので，10倍量に希釈して検出していました。 次回は十分量アプライして一次抗体の濃度を下げて検出してみようかと考えています。 > 他の蛋白アクチンなどは一定なのか？ 多少のばらつきはありますが，ヒストンほどではありませんでした。 ただ，ヒストンを検出したのと同じメンブレンを二つに切って検出したので， レーンあたりのタンパク量は0.5μgと少ないです。 こちらもレーンあたりのタンパク量を増やしてもう一度検出してみたいと思います。 しかし，ヒストンのウェスタンは難しいですね。 以前50kda程度のあるリン酸化タンパク質のウェスタンを行っていたのですが，毎回再現性よくできていました。 半年以上やってもうまくいかないと頭が痛いです。。。

(無題) 削除/引用 No.239-6 - 2009/03/27 (金) 18:18:04 - 名無し 強塩基性かつ低分子量というウェスタンには不向きなHistoneでなくて他の適当なたんぱく質をインターナルコントロールにするということではだめなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.239-5 - 2009/03/27 (金) 13:55:23 - み SDS-PAGE（0.5μg/レーン）とは何マイクロリットル　アプライされているのですか？微量すぎてアプライでばらついているとか。 あとwesternの検出の際、出るか出ないかのギリギリで勝負していると０．５や2倍の差は簡単に出るのでは？特にdensityなどで数値化すると。 ECL-plusは感度良いから少量でも検出限界以上に達するかもしれませんが、十分量をアプライし、exposeもしっかりした状態で視覚的にも差があるのか、一定なのかを判断すべきでは。 他の蛋白アクチンなどは一定なのか？

(無題) 削除/引用 No.239-4 - 2009/03/27 (金) 12:19:32 - 通りすがり ウエスタンでサンプル間のヒストン量がそろわないという現状は理解できました。 ホモジナイズの程度が違うというのは、「操作を同じようにする」ということをして 同じであるはずだと信じるくらいしか出来ないと思います、個人的に。 そうしないと、ヒストンは量があったけど、他のタンパク質の発現料が違うとしたら 同じ理由で悩まなければなりません。それを疑うようなホモジナイズはしてはいけないと思いますし、疑いだしたら、結果はでません。 対応は、２つだと思います。 １、タンパク質量の定量をテクニカル的にきちんとやれるようになる ２、タンパク量を合わせてもヒストン量が合わないのであれば、 タンパク質量ではなく、ヒストン量があうようにアプライ量を調整する １については、人によって定量はピペッティングやその他の要因でそれくらいのばらつきがでる作業です。あくまで人によってです、初心者にやらせるとめちゃくちゃだったりまします。 ご確認を。 ２について、あくまでヒストン量が一定であるはずだと考えるのであれば、ご自分がタンパク量をきちんとはかりきれていないということになります。それならば、ヒストンの検出量が同じになるようにアプライする量をいじればいじればいいのでは？ あくまで、タンパク量が同じ＝ヒストン料が同じ、ということであればです。 ほんとうにこの式が成り立つのかはわかりませんが。 あと、 ＞ヒストンを精製する目的は，ヒストン自体を精製定量することによりサンプル間のヒストン量を揃え，ヒストンの修飾変化を調べることが目的です。 よく意味がわかりません。トータルのヒストンを基準として、そのうちの修飾されたヒストンがどの程度含まれるかを各サンプル間で比較したいということでしょうか？ それならば、別に各さんぷる間でトータルのヒストン量が同じにならなくても、各々のサンプルでトータルと修飾したヒストンを比較して出した値を各サンプル間で比較すればいいのでは？ No1サンプルでは　トータルヒストン２０　修飾ヒストン１０　　割合５０％ No2サンプルでは　トータルヒストン１０　修飾ヒストン５　　　割合５０％ No3サンプルでは　トータルヒストン１５　修飾ヒストン５　　　割合33.3％ 私だったら、以上のすべてのことを考えて結果を表します。

ありがとうございます。 削除/引用 No.239-3 - 2009/03/27 (金) 11:45:49 - だめだめ >１つ目の段落の「サンプル間でそろわない」とは、どういうサンプル間？ 成育環境条件の異なったチキン（週齢は同じ）から採集した脳組織です。 無修飾ヒストンH3をインターナルコントロールとして検出しました。 ウェスタンの大まかな流れは 1. 脳全体からある部分の脳組織を切り出し，液体窒素で凍結した後，-80℃で保存。 2. SDS-sample bufferを加えて，モーターペッスルでホモジェナイズ 3. 4℃,15,000rpm,20min遠心して上清を回収。これを二回繰り返す。 4. BCA法で定量。 5. 15%ゲルでSDS-PAGE（0.5μg/レーン） 6. セミドライ式もしくはウェット式でPVDFにブロット 7. 2.5% BSA in TBS-Tで1時間ブロッキング 8. TBS-Tで10min*3回wash 9. 抗ヒストンH3（無修飾）抗体，室温，１時間反応 10. TBS-Tで10min*3回wash 11. 二次抗体，室温，１時間反応 12. TBS-Tで10min*3回wash 13. ECL-plus,　室温, 5min反応 14. LAS3000で検出 15. ImageJで定量 > そして、脳からのヒストンを精製するとは、単に脳をウエスタンのサンプルとして使うのではなく、 > ヒストンを精製するというのは、ヒストンが出ないから濃縮するという意味でしょうか？ 単にウェスタンのサンプルとして使いたいだけです。 ヒストン自体のシグナルはシングルバンドであること，サイズもあっていることから検出はできていると思います。 しかし，シグナルを定量しても0.5から２倍程度のばらつきがありました。 現在の方法ではサンプル間のホモジェナイズの程度にばらつきがあるからtotalタンパク量を揃えてもヒストンの量が揃わないのではないかと思いました。なので，ヒストンを精製する目的は，ヒストン自体を精製定量することによりサンプル間のヒストン量を揃え，ヒストンの修飾変化を調べることが目的です。

(無題) 削除/引用 No.239-2 - 2009/03/27 (金) 08:17:27 - 通りすがり 状況がよくわかりません。 １つ目の段落の「サンプル間でそろわない」とは、どういうサンプル間？ その１つ目の段落から「なので」という次の段落の発想にいく意味がよくわかりません。 そして、脳からのヒストンを精製するとは、単に脳をウエスタンのサンプルとして使うのではなく、 ヒストンを精製するというのは、ヒストンが出ないから濃縮するという意味でしょうか？ ？

脳組織から抽出したヒストンのウェスタンブロット 削除/引用 No.239-1 - 2009/03/27 (金) 01:57:29 - だめだめ 現在、脳組織をSDSサンプルバッファーでホモジェナイズし、その抽出液を用いてヒストン修飾抗体でウェスタンブロットを行っています。 しかし，抽出液をBCA法で定量して，インターナルコントロールとして抗ヒストン抗体でウェスタンブロットをしても，サンプル間でヒストン量がそろいません。 なので，脳からヒストンを精製してウェスタンを行おうと思っています。 細胞からのヒストン精製法はよく見かけるのですが，組織からの精製法はよくわかりません。 どなたか，脳組織からの抽出液でヒストン修飾抗体のウェスタンを行っている方がいらっしゃいましたらプロトコルを教えていただけませんか？ 半年ほど困っています。

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