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(無題) 削除/引用 No.238-14 - 2009/06/17 (水) 00:46:12 - andy 質問なんですが、どうして低温培養するといいんですか？ 低温培養は通常の場合とどのような違いがあるんですか？ すみません。まだ研究を始めたばかりで… 教えていただけたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.238-13 - 2009/03/31 (火) 16:25:40 - 通りすがり まったく回収できないのなら、溶菌がうまく行っていないのでは？ ・試薬がおかしい（1mlから回収できてるからこれはないか） ・溶菌時にしっかりと混ざっていない ・溶菌時間が短い これくらいしか思いつかないです。

(無題) 削除/引用 No.238-12 - 2009/03/31 (火) 15:46:52 - 中年 えっと、わずか４時間の培養で集菌しているのは何か理由があるのですか？そのせいで菌体量が少なすぎるだけだと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.238-11 - 2009/03/31 (火) 10:00:54 - あるば クローニングしたときにコロニーからちゃんと取れているのであれば、 通りがかりさんの言われているプレートかき取りが一番手っ取り早いのでは。 LB10mLで4時間培養する位の量なら、プレート1枚にべたっと生やせば 十分だと思います。

文字化けのようですね 削除/引用 No.238-10 - 2009/03/30 (月) 21:18:23 - 困った また、文字化けしたようですね。 30ºCで培養スタート。培養開始後２時間目に100ug/ml分のamp追加。培養開始後４時間目に、プラスミドの回収をアルカリ法でトライしました。 これは、 30度で培養スタート。培養開始後２時間目に が正確な表現です。書き損ないましたが、初めにエクスパンドしたLBにも当然、ampは入っています。つまり、初めからLB-ampの状態でスタートし、倍量になるよう２時間目に追加したということです。 　何か何をやってもダメなような気がして来て、かなり落ち込んでいます。かなり心理的にしんどいです、こういう時は。

やってみたのですが 削除/引用 No.238-9 - 2009/03/30 (月) 21:13:14 - 困った 本日、戻って来て早速、500ulのmini prep culture（この溶液1mlからはちゃんと予想通りの切断パターンのプラスミドが回収出来ることを確認している）をpellet downそして、LB-Ampで２回洗浄しました。そのペレットを元と同じ量のLB-ampでケンダクし、10mlのLB-AMPへ加えました。 30ºCで培養スタート。培養開始後２時間目に100ug/ml分のamp追加。培養開始後４時間目に、プラスミドの回収をアルカリ法でトライしました。 しかしながら、結果は全く、回収出来ずです。電気泳動しても何も見えません。 　何故こんなことになっているのか...。もう何度アルカリプレップをやったか数えきれません。 ベクターですが、FLP-INを利用する関係上、現在使用中のpcDNA5/FRTを使用したいと考えています。加えて、ゼロから作り直すには時間的制約がありかなり厳しい状況です。

(無題) 削除/引用 No.238-8 - 2009/03/27 (金) 16:23:06 - ~ もし、近所のラボでstbl2, stble3, stble4, SuREなどのウイルスベクター用のコンピを持っているラボがありましたら、 少し分けてもらって、試してみてはいかがでしょうか。

低温培養 削除/引用 No.238-7 - 2009/03/27 (金) 16:05:47 - めい 培養温度ですが、僕の場合30度で独立して培養した8クローン全て欠失していたものが、25度では欠失2クローンまで減りました。コピー数以外にも何かあるかもしれないと思っています。30度でダメだった場合あきらめずに25度も試してみては？

(無題) 削除/引用 No.238-6 - 2009/03/27 (金) 09:21:16 - ~ >プロモーター15kbの領域とルシフェラーゼを連結したプラスミド これの骨格は何でしょうか？ 前にこのくらいのサイズのインサートを扱っていたときは、 PACに挿入していました。 BACをお持ちなのですから、 BACからインサートを除いた空ベクターを作って、 それに >プロモーター15kbの領域とルシフェラーゼを連結 を入れてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.238-5 - 2009/03/26 (木) 20:30:02 - 困った なるほど。早速のご助言、有り難うございました。 LB-ampでpellet washしてやってみます。 また、30度でtryしてみます。 明日から、学会なのですぐには実験できないのですが、来週、また結果をご報告申し上げたいと思います。まずは早速返信頂いた御礼まで。

(無題) 削除/引用 No.238-4 - 2009/03/26 (木) 20:19:49 - 中年 1. 500uLのo/n cultureにしこたま含まれているβ-ラクタマーゼは10mLに含まれるアンピシリンを瞬時に分解するのにお釣りが来るくらい十分であるため、そのプラスミドが大腸菌の生育に悪さをするものである場合、プラスミドを脱落させた選択の掛かっていない菌が増えてしまうため。 500uLのo/n cultureに含まれる菌体を遠心で回収し、アンピシリンを含む培地で１回洗浄した後、スケールアップする培地に植菌する。培養は一貫して30℃で行うことにする。これによりプラスミドのコピー数が低下し、毒性が緩和されてプラスミドが安定化する（pUC oriのプラスミドに限る）。ただし、コピー数が低下するため収率が落ちるので、培養のスケールはさらに大きくする。 2. 上の後半参照

(無題) 削除/引用 No.238-3 - 2009/03/26 (木) 20:18:35 - 通りがかり ・低温（たとえば30℃）で培養する ・液体培養でなく、プレート上にまいて多数のコロニーを出し、これを掻き取ってプラスミドを調製する。 などが効果がある場合があります。

(無題) 削除/引用 No.238-2 - 2009/03/26 (木) 20:01:06 - 困った 文字化けしたようですが、2nd パラグラフの一行目は、 「一度は37ºCでpick upしたコロニーからミニプレップで制限酵素切断したところ、目的のプラスミドがとれたのですが、」 ではなく、 「一度は37度でpick upしたコロニーからミニプレップで制限酵素切断したところ、目的のプラスミドがとれたのですが、」 です。 大変、困っております。何故、こんな分けの分からないことが起こるのか？ 大変苦しんでいます。お助けください。

25kbのプラスミド問題 削除/引用 No.238-1 - 2009/03/26 (木) 19:54:55 - 困った 大変、困ったので助けてください。 当方、現在、BACクローンからRED/ETシステムで引き抜いたプロモーター15kbの下にルシフェラーゼレポーターを入れたプラスミドを作成し、FLIP-INのシステムで細胞の特定部位にレポーターコンストラクトを入れようとしています。しかしながら問題はBACクローンから目的となるプロモーター15kbの領域とルシフェラーゼを連結したプラスミドを作成したところから始まりました。 　一度は37ºCでpick upしたコロニーからミニプレップで制限酵素切断したところ、目的のプラスミドがとれたのですが、20ulのmini-prep sultureから10ml LB-ampなどにスープアップして培養すると、プラスミドがGC richのせいか、非常に高頻度で欠失を起こすのです。元あったプラスミドの切断パターンからは似ても似つかぬ欠失体がほとんどになってしまいます。 　希釈した倍率が大きすぎたのかもと考え、Mini-prepを大きめの2mlなどのスケールで行ない、500ulのfull growth mini-prepから10mlへスープアップしたところ、何度やってもプラスミドも何も回収出来ません。使用している大腸菌ホストはBACのホストであるDH10Bです。 　プラスミドが不安定になっているようなので、mini-prepで回収したプラスミドDNAをそのままゲルにアプライ、スーパーコイル以外に薄く引くような形で欠失プラスミドが見えたので、スーパーコイルの部分だけをゲルから回収、STBL3にエレクトロポレーションしましたが、何度やってもSOC培養を37度で５時間まで引っ張っても何も生えて来ません。 1. Full growth mini prep 500ulを10mlへスープアップした際にどうして何も回収出来ないのか？ 2. こういった不安定なプラスミドを相手にする場合は、どうすればいいのか？ よろしくご助言お願いします。

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