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(無題) 削除/引用 No.2378-5 - 2010/04/12 (月) 19:51:21 - エクストラ 皆様ありがとうございます。 質問の要点をまとめると、３０秒の伸長時間でなぜ大サイズのバンドが見られたのか？ということでした。 私の実験系の過剰テンプレート存在下では、おかしなアニーリングが生じやすくなり、これによって生じたおかしなPCR産物が、さらにPCR産物同士でアニーリングすると、短めの伸長時間でも大きなサイズの増幅が起こりうるということで理解しました。

(無題) 削除/引用 No.2378-4 - 2010/04/12 (月) 19:17:18 - ~ 25ng/20uLのテンプレートというのは、プラスミドのテンプレートとしては過剰だと思います。 回しているのが5~6サイクルというわけではありませんよね。 そのテンプレートの量で10サイクル以上回しているのでしたら、 おかしなアニーリングが起きても不思議ではないのですが。

(無題) 削除/引用 No.2378-3 - 2010/04/12 (月) 15:52:24 - ；； PCRが思った通りにできていない それ以外に何が言えるのでしょうか？答えなんて誰もわからないし、 色々挙げたところで正解って誰もわからないです。

(無題) 削除/引用 No.2378-2 - 2010/04/12 (月) 15:04:21 - aimar PCR産物同士がアニーリングして、長い断片が出来るのでは？

PCRのエキストラバンド 削除/引用 No.2378-1 - 2010/04/12 (月) 14:30:42 - エクストラ 現在作成中のコンストラクトのインサートチェックのために、ミニプレップ後のプラスミドを、ベクターに設計したフォワードプライマーとインサートの中程に設計したリバースプライマーでPCRしています。インサートがベクターに挿入されていれば300bpのDNA断片が増幅できるはずです。しかし、目的産物の増幅は見られませんでした。 この時、PCRの伸長時間を30秒に設定したにも関わらず、500 bp以上のサイズのエクストラバンドが５本以上現れています。4kbくらいにもバンドが見えています。このような短い伸長時間で現れる異常に長いバンドはどのように生じるのでしょうか。ベクターは10kb以上なので、ベクターのcccが見えているのかもしれませんが、しかしPCR後の電気泳動でバンドを確認できるほどテンプレートを投入していません。(20ul系のPCRでテンプレート25ng程度ですが、出てきたバンドは経験上知っている25 ngのラムダDNAと比べても明るく見えます）。 同じプライマーセットでインサートチェックできる別のタイプのプラスミドを同時に作成していたのですが、こちらではちゃんとインサートが確認できていますので、PCRの実験系にはおそらく問題はないと考えています。使用した酵素はKOD-fxです。ちなみに上記プラスミドの中身は制限酵素処理とシーケンスで確認しようとしています。

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