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(無題) 削除/引用 No.2375-6 - 2010/04/14 (水) 18:24:38 - 匿名 レトロ様 遺伝子Aと遺伝子Bは同じ耐性マーカーで選択されるようになっているのでしょうか？もしそうだとしたら、遺伝子Bが細胞増殖に不利に働くものだとBを発現する細胞はいなくなってしまうと思います。細胞にとってはAだけ持っていればマーカー選択に打ち勝つことができますので。先に書かれた方もおられますが、NeoとPuroなどといったふうに別の選択マーカーを使う必要があると思います。 別々の選択マーカーをつかっても共発現細胞が得られないことがあり、私も何度か経験したことがあります。理由は分からないのですが、共発現が細胞の増殖や生存に著しく不利に働くとき、共発現のstable細胞が得られないのではないかと考えています。2段階目にPuroなど切れ味のよい選択マーカーを用いると、選択には耐えたのに増殖しない／遅れて死ぬなどの現象が見えてきます。これらの現象は一過性発現の実験では見られないこともあるため、stableを作製しようとして初めて気づいたりします（涙）

(無題) 削除/引用 No.2375-5 - 2010/04/14 (水) 16:43:26 - ats 遺伝子Ａを発現した細胞の増殖率が低下すると、レトロウィルスは感染しにくくなるかもしれません。この場合、非増殖細胞にも感染するレンチウィルスベクターに変更すると良いかもしれません。 （レンチウィルスも増殖細胞の方が感染効率が高いようです） また、遺伝子Ａを発現した細胞では、細胞表面のレトロウィルスレセプター（レトロウィルス結合分子）が減少したりすることはないでしょうか。一過性発現のVSV-Gエンベロープなら問題が起きないと思いますが、エンベロープタンパクを恒常発現するパッケージング細胞を使っていると落とし穴かも。

(無題) 削除/引用 No.2375-4 - 2010/04/14 (水) 15:43:47 - あ pMXの経験はありませんが、クロンテックのpQCXIシリーズで二重に感染できました。 ネオとピューロを順番に、と、同時、に感染させてどちらも薬剤耐性で選択できました。 ピューロとネオを加えてほっといてので、効率が下がってしまうかは確認してません。

(無題) 削除/引用 No.2375-3 - 2010/04/11 (日) 17:42:04 - レトロ USB様 アドバイスありがとうございます。 また私の書き込みの不備を指摘いただきありがとうございます。 使用していますベクターはpMXsベクターで、遺伝子Ａ及びＢをそれぞれ同じベクターに別々にクローニングしたものを使用しております。 >遺伝子Aと遺伝子Bを発現させるためのプロモーターは別のものを使用されていますか？ 上記いたしましたとおり、全く同じプロモータを使用しているため、ご指摘の通り、そこに原因がある可能性も十分にあります。 私がそれでも実験を進めた理由と致しまして、レトロウイルスベクターではなく、遺伝子Ａ及びＢをpMXsべクターにクローニングしたものを、上記した細胞株に「lipofection」したところ、（一過性に）共発現したくれたため、ウイルスベクターにしてもうまくいくだろうと考えたためです。 ＵＳＢ様に教えていただきたいのですが、 プロモータが同じものをco-lipofectionで共発現してくれたことが確認できたとしても、ウイルスベクターでうまくいくとは限らないのでしょうか？ 勉強不足は否めませんがどうか教えていただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2375-2 - 2010/04/11 (日) 13:32:11 - USB レトロ様 　もう少し詳しい情報を書かれた方が皆さんアドバイスしやすいように思います。レトロベクターの種類や使用しているプロモーターなど。 　とりあえずプロモーターについて、遺伝子Aと遺伝子Bを発現させるためのプロモーターは別のものを使用されていますか？例えば、両方CMVを使用してたりするとうまく発現しないとおもいます。 　原因がそこにあるのならそれぞれ別のプロモーターを使用したり、IRES等を使用して一つのベクターで同時に2つの遺伝子を発現させたりすることで改善可能と思います。

レトロウイルスベクターで二度目の感染が成立しない 削除/引用 No.2375-1 - 2010/04/11 (日) 12:02:23 - レトロ みなさまお世話になります。 現在、レトロウイルスベクターを利用して安定発現細胞の樹立を試みています。 まず、ある細胞株Ｘに遺伝子Ａを発現させるためレトロウイルスＡベクターを感染させました。ＧＦＰが一緒に発現するようになっておりますので、cell sorterを用いて感染細胞を単離しました。 その後、遺伝子Ａを発現したその細胞に、遺伝子Ｂを更に発現させるためレトロウイルスウベクターＢを感染させました。 ところが、Ｂを共発現するような細胞は得られませんでした。 ちなみに、未感染細胞ＸにレトロウイルスベクターＢの単独感染では５０％以上もの細胞が感染していることは確認済です。 ここで、みなさまにお聞きしたいことは、レトロウイルスをsequentialに感染させることはできないのでしょうか？なぜ二度目のウイルスには感染しなかったのでしょうか？ ちなみにウイルスベクターＡとＢを「同時に」感染させることは自分の実験上避けなければなりません。どうしてもsequentialにやる必要があります。 どうか、みなさまの経験に基づいたアドバイスをいただけますと幸いです。よろしくお願い致します。

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